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May 27, 2023

La quercetina inhibe la proliferación de taquizoitos de Toxoplasma gondii y actúa sinérgicamente con la azitromicina.

Parasites & Vectors volumen 16, Número de artículo: 261 (2023) Citar este artículo 554 Accesos Detalles de métricas La quercetina (QUE) es un polifenol natural conocido por tener numerosas propiedades farmacológicas.

Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 261 (2023) Citar este artículo

554 Accesos

Detalles de métricas

La quercetina (QUE) es un polifenol natural conocido por tener numerosas propiedades farmacológicas contra enfermedades infecciosas y no infecciosas. La azitromicina (AZ) es un antibiótico que pertenece a la clase de antimicrobianos azálidos y un antiparasitario que se sabe que es eficaz en combinación con clindamicina contra los taquizoítos de Toxoplasma gondii resistentes a pirimetamina/sulfadiazina en entornos clínicos. Se sabe que ambos compuestos se dirigen a la síntesis de proteínas y tienen propiedades antiinflamatorias. Sin embargo, se sabe poco sobre la interacción sinérgica de QUE y AZ contra el crecimiento de T. gondii. Aquí, informamos por primera vez los efectos de la combinación de QUE y AZ sobre el crecimiento de T. gondii. Se determinó que la concentración inhibidora del 50% (CI50) para QUE a las 72 h de interacción era 0,50 µM, mientras que AZ dio un valor de CI50 de 0,66 µM a las 72 h de interacción con los parásitos. Las pruebas combinadas de QUE y AZ en una proporción de 2:1 (QUE:AZ) mostraron un valor de IC50 de 0,081 µM. Curiosamente, se observó un valor de índice inhibidor fraccional de 0,28, lo que indica una fuerte sinergia. También se descubrió que QUE regula positivamente la generación de especies reactivas de oxígeno y causa disfunción de la membrana mitocondrial de los taquizoitos de T. gondii tanto intracelulares como extracelulares. En general, los resultados indican que QUE es una ventaja novedosa capaz de crear sinergia con AZ para inhibir el crecimiento de T. gondii y puede merecer una investigación futura in vivo para el posible desarrollo de fármacos combinados.

La toxoplasmosis es una enfermedad parasitaria global desatendida causada por el parásito protozoario intracelular obligatorio Toxoplasma gondii. Se sabe que la enfermedad afecta tanto a las células huésped de sangre caliente como a las de sangre fría [1,2,3] y se ha informado que más de un tercio de la población mundial está infectada con T. gondii [1, 3], incluyendo alrededor de 40 millones de personas en los EE.UU. [4]. También es motivo de gran preocupación que haya alrededor de 1,20 millones de casos de toxoplasmosis congénita en todo el mundo [5], y entre 400 y 4000 casos se notifican anualmente en los EE. UU. [4]. El número puede ser mayor ya que no todos los estados de EE. UU. realizan pruebas de seroprevalencia de T. gondii en mujeres embarazadas. De hecho, sólo unos pocos estados, como Massachusetts y New Hampshire, realizan pruebas de detección de toxoplasmosis congénita durante las visitas prenatales [6, 7].

La infección por Toxoplasma gondii en la mayoría de los individuos inmunocompetentes es clínicamente asintomática. Sin embargo, las personas inmunocomprometidas (por ejemplo, pacientes infectados por el VIH, pacientes con cáncer, pacientes sometidos a trasplantes de órganos y aquellos que reciben transfusiones de sangre) presentan signos clínicos que pueden variar desde leves hasta potencialmente mortales [4, 8, 9].

Toxoplasma gondii se adquiere mediante la ingestión de quistes tisulares en carne cruda o sin cocer, suelos contaminados, agua y productos alimenticios contaminados [2]. Los dos tratamientos de primera línea para la infección por T. gondii en humanos son la terapia combinada con sulfadiazina (SDZ) y pirimetamina (PYR) y la terapia combinada con trimetoprim y sulfametoxazol [10, 11]. Sin embargo, estos medicamentos se asocian con efectos adversos graves para la salud, como la inducción de leucopenia, neutropenia, reacciones de hipersensibilidad, trombocitopenia, supresión de la médula ósea y anemia megaloblástica, en pacientes con un recuento de plaquetas muy bajo [10,11,12,13,14 ,15,16,17,18]. Estos desafíos requieren más investigación para encontrar nuevos anti-T. gondii inhibidores contra la toxoplasmosis que pueden funcionar como terapia única o en combinación con otros medicamentos.

La azitromicina (AZ) es un antibiótico macrólido derivado de la eritromicina y que ha sido ampliamente investigado y demostrado ser un agente anti-Toxoplasma eficaz en caso de fracaso del tratamiento con la combinación pirimetamina/sulfadiazina. Este antibiótico es estructuralmente similar a la eritromicina, con altas propiedades antibacterianas y un perfil farmacocinético deseable. Se ha demostrado que AZ bloquea la traducción en el apicoplasto plasmodial normalmente activo traslacionalmente y, por lo tanto, se ha aplicado generalmente en el tratamiento de la neumonía y la clamidia, especialmente en mujeres embarazadas [18]. Además, se ha demostrado que AZ controla la infección por T. gondii en explantes de vellosidades humanas [19].

La quercetina (QUE) es un flavonoide polifenólico que se encuentra en la mayoría de los alimentos vegetales, suplementos herbales, verduras, frutas, té, vinos tintos y semillas. Contiene un amplio espectro de propiedades biológicas que tienen capacidades protectoras, como efectos antiinflamatorios [20, 21], antimutagénicos [22], anticancerígenos [23] y antioxidantes [24], propiedades antibacterianas inherentes contra Escherichia coli [25] y reducir o prevenir enfermedades cardiovasculares [26]. Estudios anteriores han demostrado que QUE tiene sinergia con amoxicilina en la eliminación de Staphylococcus epidermidis [27], así como con otros antibióticos, como levofloxacina, ceftriaxona, gentamicina, tobramicina y amikacina contra Pseudomonas aeruginosa [28] y con galato de epigalocatequina contra Leishmania. [29]. Sin embargo, se sabe poco sobre la interacción de QUE con AZ contra el crecimiento de T. gondii.

En el presente estudio, probamos QUE solo y su combinación con AZ, para probar la hipótesis de si se produciría sinergia.

Las células Vero (un linaje originalmente aislado de células epiteliales renales extraídas de un mono verde africano) que expresan luciferasa de luciérnaga (Luc2p) se obtuvieron del Repositorio de Recursos de Investigación de Infecciones Emergentes y Biodefensa de los NIH (BEI Resources, Manassas, VA, EE. UU.; NAID; NIH; NR -10385). La cepa virulenta RH-(YFP)2 de Toxoplasma gondii tipo I, que expresa la proteína fluorescente amarilla (YFP)2, fue proporcionada amablemente por el Prof. William H. Witola (Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Illinois, Urbana Champaign, IL, EE. UU.). Las células Vero se cultivaron en un matraz T-25-cm3 que contenía medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) suplementado con penicilina-estreptomicina (PS) al 1% y solución de anfotericina B como antibióticos ( Gibco, Thermo Fisher Scientific) y suero fetal bovino (FBS) al 10% (Life Technologies Inc., Thermo Fisher Scientific. Los cultivos se mantuvieron a 37ºC con 5% de CO2 para que confluyeran. Taquizoítos de Toxoplasma gondii de cepas virulentas RH-tipo salvaje ( WT) sin etiqueta fluorescente y células hTERT (fibroblastos) fueron proporcionadas por la Prof. Silvia NJ Moreno (Universidad de Georgia, Atenas, GA, EE. UU.).

Se sembraron células Vero (6 x 104 células/200 µl) en placas negras de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C con 5% de CO2. A las 24 h, se lavaron las células Vero para eliminar las células muertas y se agregaron 100 µl de medio de crecimiento a las células. Se agregaron QUE y AZ en un volumen de 100 µl en concentraciones de 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 y 0 µM, respectivamente, y se incubaron durante 48 h. Después de 48 h, se agregaron 10 µl de tinte azul Alamar (Abcam, Waltham, MA, EE. UU.) a los pocillos de cultivo, y las placas se cubrieron con papel de aluminio y se incubaron en condiciones de cultivo estándar. La fluorescencia se midió a 560/630 nm utilizando el lector de placas fluorescentes infinito Tecan 200F (Tecan Group, Männedorf Suiza). Los experimentos se realizaron en tres experimentos independientes y los resultados se presentaron como media ± desviación estándar (DE) (n = 3).

QUE y AZ se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX, EE. UU. y se prepararon en dimetilsulfóxido (DMSO). Se utilizaron taquizoitos RH-(YFP)2 de T. gondii que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP)2 en todo el cultivo. para probar el efecto inhibidor de QUE solo y en combinación con AZ sobre los parásitos T. gondii in vitro. Se sembraron células Vero (6,0 x 104 células/(200 µl) en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C con 5% de CO2. durante 24 h para una confluencia del 90%, tras lo cual se añadieron a las células Vero exactamente 100 µl de taquizoítos recién purificados a una concentración de 1 × 104 parásitos/pocillo. Se añadieron el compuesto experimental QUE y el fármaco estándar (AZ) en un volumen de 100 µl en concentraciones 0, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5 y 25 µM, respectivamente, y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO 2. El crecimiento de Toxoplasma gondii a 72ºC del cultivo se midió utilizando un lector de placas fluorescentes infinito Tecan 200 F con excitación. fijado a 485 nm y emisión fijada a 535 nm (Grupo Tecan).Las intensidades de fluorescencia se convirtieron en porcentaje de inhibición utilizando la fórmula informada en [30]. Las concentraciones de los compuestos QUE y AZ se representaron frente al porcentaje de inhibición del crecimiento de T. gondii utilizando el software GraphPad Prism 9.2 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Los experimentos se realizaron en tres experimentos independientes y los resultados se presentaron como la media ± DE (n = 3).

A las 72 h después del tratamiento con QUE y AZ, las placas se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x para eliminar todos los compuestos y todos los parásitos extracelulares. Después del lavado, se agregaron a cada pocillo 100 µl de DMEM suplementado con FBS al 10 %, seguido de una lectura inicial como el día 0. La intensidad de la fluorescencia del parásito se registró durante las siguientes 72 h, y las concentraciones mínimas efectivas del 50 % se determinaron a las 72 h para determinar si los compuestos eliminados todavía tenían algún efecto sobre el crecimiento de los taquizoitos. Los pocillos de control negativo (donde no se agregaron medicamentos previamente) sirvieron como punto de referencia del 100 % y el postratamiento con retirada de QUE y AZ sirvieron como pocillos experimentales. Los valores de CI50 se determinaron como se indicó anteriormente en el ensayo de inhibición del crecimiento individual. Los experimentos se realizaron en tres experimentos independientes y los resultados se presentaron como la media ± DE de ensayos por triplicado (n = 3).

Se sembraron células Vero (6,0 x 104 células/200 µl) en placas de 96 pocillos durante 24 h, como se describió anteriormente para probar compuestos individuales, seguido de la purificación de taquizoítos RH- (YFP) 2 como se describió anteriormente. La concentración de parásitos utilizada en los estudios individuales descritos anteriormente se añadió en un volumen de 100 µl, seguido de la adición de fármacos en una proporción de 1:1 (50 µM QUE: 50 µM AZ), 2:1 (50 µM QUE : 25 µM AZ) y 1:2 (25 µM QUE: 50 µM AZ), se diluyeron en serie y se controló el crecimiento del parásito usando el lector de placas fluorescentes infinitas Tecan 200F (Tecan Group) con los filtros configurados a 458 nm/535 nm como longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente. El crecimiento del parásito se controló durante 72 h y los valores de IC50 se calcularon a partir de los datos de interacción a las 72 h utilizando el software GraphPad prism versión 9.2.0 (software GraphPad). Los experimentos se realizaron en tres experimentos independientes y los resultados se presentaron como la media ± DE de ensayos por triplicado (n = 3). Para descifrar la combinación que podría ejercer sinergia y adictividad para futuras modificaciones, utilizamos la concentración inhibidora fraccionada (FICI). La sinergia se definió como una inhibición IC50 producida por una combinación de compuestos (QUE-AZ) que es mayor que la suma de los efectos de concentración inhibidora producidos por QUE o AZ solos. Los valores de FICI se determinaron usando la fórmula reportada en [31,32,33]: FICI = IC50p de QUE en combinación (QUE-AZ [1:1, 1:2 o 2:1]/IC50p de QUE solo + IC50p de AZ en combinación (QUE-AZ [1:1, 1:2 y 2:1])/IC50p de AZ solo. Utilizamos una guía estándar que establece que los valores de FICI < 0,5 se consideran sinérgicos; los valores de FICI ≥ 1 indican una Los valores aditivos y FICI ≥ 2 indican una interacción antagónica [31].

Se ha informado anteriormente que QUE induce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en Leishmania amazonensis. Para verificar si QUE tuvo algún efecto sobre la producción de ROS en taquizoitos de T. gondii, utilizamos un procedimiento similar al informado en un estudio anterior [30] con modificaciones. Los taquizoitos WT T. gondii proporcionados por Silvia NJ Moreno (Universidad de Georgia, Atenas, GA, EE. UU.) se mantuvieron en medios de crecimiento sin rojo de fenol en células intactas. Recolectamos parásitos RH-Wild tipo (RH-W) recién lisados ​​pasándolos a través de una aguja de calibre 27 seguido de filtración a través de un filtro de 3 µm. Se sembraron parásitos RH-W (1,60 × 106 parásitos/50 µl por pocillo) en placas negras de 96 pocillos y se trataron con H2O2 (500 µM) como control positivo [34] o con QUE en diferentes concentraciones (0,66 y 12,5 µM). ), durante 30 min a 37 °C con 5% de CO2. Después de una incubación de 30 minutos, se añadió colorante ROS (Abcam) y los pocillos se incubaron durante 45 minutos más según el protocolo del fabricante y el trabajo previo [35]. Las intensidades de fluorescencia de los pocillos se midieron con una excitación de 485 nm y una emisión a 563 nm, respectivamente, utilizando el lector de microplacas infinito Tecan 200F (Tecan Group). Los experimentos se realizaron en tres experimentos independientes y los resultados se presentaron como la media ± DE de ensayos por triplicado (n = 3).

Para las mediciones del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), utilizamos el tinte catiónico JC-1 como sonda fluorescente (Abcam), como se describió anteriormente [30, 36]. Este kit de potencial de membrana se ha utilizado ampliamente en pruebas in vitro del potencial de membrana mitocondrial de taquizoitos de T. gondii [35, 37,38,39,40], con modificaciones. Medimos el ΔΨm intracelular y extracelular del parásito. Para el ensayo intracelular, se sembraron 6 x 104 células Vero en pocillos de una placa negra de 96 pocillos con fondo transparente (Costar, Corning Inc., Corning, NY, EE. UU.) hasta que confluyeron. Luego se agregaron 6 × 104 taquizoitos de cepas de T. gondii RH-WT. Por el contrario, en el ensayo de parásitos extracelulares, se sembraron directamente en los pocillos 1 x 105 parásitos recién purificados en 100 µl de medio (sin células huésped). Luego, se añaden 100 μl de solución que contiene 0,625 y 16,67 μM de QUE como fármaco experimental, 50 μM de m-clorofenilhidrazona de cianuro de carbonilo (CCCP; Alfa Aesar, Haverhill, MA, EE. UU.) como control positivo o 1 × HBSS (ensayo buffer) el control negativo se añadió a los pocillos designados y se incubó durante 8 h a 37 °C con 5% de CO2 [30, 36]. Se añadió una alícuota de 10 µl de JC-1 a los pocillos y las placas se cubrieron con papel de aluminio y se incubaron durante 45 minutos. Luego se retiraron las soluciones y se centrifugaron a 12 °C, 2000 rpm durante 5 min, y se eliminó el sobrenadante. A continuación, se agregaron 100 µl de tampón de ensayo a cada pocillo y se centrifugaron nuevamente en las mismas condiciones y se descartó el sobrenadante. Los sedimentos del parásito se resuspendieron en solución con 100 µl de tampón de ensayo para el ensayo extracelular. Para el ensayo intracelular, se descartó el sobrenadante y luego se agregaron 100 µl de tampón de ensayo. Se tomaron imágenes de los ensayos de parásitos intracelulares y extracelulares utilizando un microscopio de fluorescencia EVOS FL (Invitrogen Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). Los experimentos se realizaron por triplicado (n = 3) [36].

Para validar aún más los resultados de nuestro ensayo de mitocondrias, utilizamos un protocolo modificado [30, 37, 39]. Se incubaron parásitos RH-RFP extracelulares frescos (2,84 × 104) en un medio completo que contenía QUE en concentraciones de 0,62 y 16,67 µM, en medio completo sin el fármaco (medio solo con parásitos como control negativo) o en medio que contenía H2O2 500 µM como un control negativo. Después de 8 h de incubación en condiciones de cultivo estándar de 5% de CO2 a 37 °C, se utilizó el kit de ensayo de detección de ATP - Luminiscencia (n.º de catálogo 700410; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EE. UU.) para medir la luminiscencia de las muestras. . QUE (el fármaco tratado), el control positivo (H2O2) y el control negativo (medio con parásitos sin fármacos) se lavaron dos veces con PBS y los sedimentos se lisaron en hielo con 100 µl de tampón de lisis. A continuación, se agregaron 10 µl de los lisados ​​del parásito a 100 µl de solución de trabajo de detección de trifosfato de adenosina (ATP) en cada pocillo de microplaca opaca (Corning). Las placas se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente según el protocolo del kit de ensayo de detección de ATP, se retiraron las cubiertas de las placas y se midió la luminiscencia utilizando el lector de microplacas multimodo de imágenes celulares BioTek Cytation con software Gen 5.3.1 ( Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EE. UU.). El efecto de los tratamientos sobre la luminiscencia de ATP de T. gondii se comparó con la luminiscencia de ATP de la población de T. gondii no tratada (medio con parásitos sin fármacos experimentales ni controles negativos) y se expresó como porcentajes de estos valores de ATP de control. Los experimentos se realizaron en tres experimentos independientes y los resultados se presentaron como la media ± DE de ensayos por triplicado.

Se utilizó el software GraphPad Prism (GraphPad Software) para determinar los valores de IC50. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para distinguir cualquier diferencia estadística. Se consideró significativo un valor de p de 0,05.

Se determinó que los valores de CI50 para QUE y AZ contra el crecimiento de taquizoitos de T. gondii a las 72 h eran 0,50 µM y 0,66 µM, respectivamente (Tabla 1).

Las curvas de crecimiento del parásito, como porcentaje de inhibición del crecimiento, en presencia de diferentes concentraciones de AZ y QUE, respectivamente, se presentan en las Fig. 1a, b. Curiosamente, los valores de CI50 en nuestro estudio actual para ambos compuestos individuales son comparativamente similares a los típicos de los fármacos utilizados actualmente que PYR y SDZ informaron utilizando células HFF (0,95–1,55 µM para SDZ y 2,42–3,52 µM para PRY [30]; 1,17 ± 0,076 para palanca [41]); 0,79–1,5 µM para PYR [42]; 3,4 µM para PYR [32]; 0,8 µM para PYR [43]; 0,16 µM para PYR [44]).

Curvas de inhibición del crecimiento de Toxoplasma gondii a las 72 h en presencia de quercetina (a) y azitromicina (b) en concentraciones de interacción 0, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5 y 25 µM. Los datos se presentan como medias (círculos rellenos) de tres experimentos independientes realizados por triplicado, con el error estándar de la media (bigotes).

Se realizó un tratamiento combinado con QUE y AZ para determinar si estos fármacos podrían tener sinergia contra el crecimiento de T. gondii in vitro. Observamos que el tratamiento combinado con QUE y ZA en una proporción de 2:1 (QUE:AZ) mostró una fuerte sinergia a las 72 h después del inicio del tratamiento. Se determinó que los valores de IC50 para el tratamiento combinado con QUE y ZA en una proporción de 2:1 (QUE: AZ), 1:2 (QUE: AZ) y 1:1 de (QUE: AZ) eran 0, 89, 1,50. y 0,081 µM, respectivamente (Tabla 1). Se calculó que las concentraciones inhibidoras fraccionarias eran 0,28. La proporción de 2:1 (QUE:AZ) fue fuertemente sinérgica según el FICI calculado (Tabla 1). Sin embargo, el tratamiento combinado con QUE y AZ en proporciones de 1:2 (QUE:AZ) y 1:1 (QUE:AZ) dio lugar a interacciones antagónicas. La curva de crecimiento para la proporción 2:1 de QUE: AZ se muestra en la Fig. 2.

Curva de crecimiento inhibidora in vitro de la cepa RH-(YFP)2 de T. gondii a las 72 h en presencia de quercetina (QUE) y azitromicina (AZ) combinadas en una proporción de 2:1 (QUE: AZ) (50 µM QUE: 25 µM AZ). Las concentraciones probadas fueron 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 y 0 µM para QUE, y 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 y µM para AZ. Los datos se presentan como las medias (círculos rellenos) de tres experimentos independientes realizados por triplicado, con el error estándar de la media (bigotes). Q+A (2.1), Quercetina: azitromicina en una proporción de 2:1

Se calculó que las concentraciones citotóxicas del 50 % (CC50) eran 14,98 µM para QUE, 2575 µM para AZ, 60,82 µM para QUE+AZ (2:1), 47,17 µM para QUE+AZ (1:2) y 37,22 µM para QUE +AZ (1:1) (Tabla 1). Los índices de selectividad (SI) para QUE, AZ y QUE+AZ (2:1) se calcularon y se presentan en la Tabla 1. Los valores de SI para las relaciones 1:1, 1:2 y 2:1 de QUE+AZ Se calculó que las combinaciones eran 31, 42 y 760,25, respectivamente. Todos los compuestos y proporciones individuales probados tuvieron un efecto inhibidor de amplio espectro sobre el crecimiento del parásito in vitro en comparación con algunos de los fármacos utilizados actualmente en el entorno clínico para tratar la infección por T. gondii.

Para descifrar si la retirada de QUE después de 72 h de tratamiento tuvo algún efecto sobre el crecimiento continuo de taquizoítos durante las primeras 72 h posteriores a la retirada del fármaco, determinamos las curvas de inhibición del parásito (Fig. 3a, b). Se observó que la retirada del compuesto no eliminó su efecto inhibidor sobre el crecimiento del parásito en relación con el fármaco estándar (AZ) probado a las 72 h (Tabla 2). Se calculó que los valores de CI50 eran 0,49 y 0,20 µM para QUE y AZ a las 72 h, respectivamente (Tabla 2).

Curvas de inhibición de Toxoplasma gondii para parásitos tratados primero durante 72 h y luego cultivados en medio de crecimiento durante 72 h después de la retirada del fármaco. a y b Representan la curva de crecimiento del tratamiento de abstinencia de quercetina y azitromicina. Los datos se presentan como la media (círculos rellenos) de tres experimentos independientes realizados por triplicado, con el error estándar de la media (bigotes).

También se sabe que la AZ tiene un efecto sobre un objetivo secundario de los parásitos a través del apicoplasto [45, 46]. Específicamente, se ha informado que la AZ afecta los niveles de lípidos y la fluidez de los lípidos de la membrana en las células [47, 48]. En conjunto, nuestros hallazgos y datos previos sugieren que la AZ podría afectar la producción de esfingolípidos y fosfolípidos en el apicoplasto, que es crucial para el ciclo lítico del parásito.

QUE provoca una alta producción de ROS y alteración de la membrana mitocondrial, lo que puede afectar la síntesis de lípidos (p. ej., fosfolípidos y esfingolípidos) directa o indirectamente en el apicoplasto y las mitocondrias. Los lípidos son cruciales para la invasión, proliferación y modulación del calcio intracelular de T. gondii que desencadena la salida de los parásitos y controla la mayoría de las actividades del ciclo lítico en el parásito T. gondii. Sin embargo, esta conjetura requiere más estudio.

Nuestra observación del efecto de que el AZ permanezca activo contra el crecimiento de taquizoitos incluso después de la retirada del fármaco confirmó su capacidad de acción prolongada debido a su alta vida media> 50 h en las células huésped [49].

Se considera que las mitocondrias son el centro neurálgico de las células eucariotas y desempeñan diversas funciones, incluida la mediación de ROS, la producción de ATP, la síntesis de ácidos grasos, la traducción y la transcripción [50]. Para comprender mejor el mecanismo de acción de QUE sobre ΔΨm, la producción de ATP y la producción de ROS, empleamos ensayos que midieron las respuestas de los parásitos intracelulares a QUE de una manera dependiente de la dosis. Los resultados mostraron el efecto de QUE en ΔΨm (ver Fig. 4a). De manera similar, observamos que QUE interrumpió el parásito extracelular ΔΨm (Fig. 4b). Además, para explorar el efecto de QUE sobre la producción de ATP del parásito in vitro, realizamos un ensayo de producción de ATP (ver resultados del ensayo en la Fig. 5). También se llevó a cabo un estudio de la generación de ROS para determinar el efecto de QUE sobre las ROS liberadas (ver resultados del ensayo en la Fig. 6). Observamos ligeras diferencias estadísticas entre 25 µM de QUE versus 50 µM de H2O2 (p < 0,026) y 12,5 µM de QUE versus 50 µM de H2O2 (p < 0,026), lo que confirma los resultados informados en un estudio previo en Leishmania amazonensis que mostró que QUE Provoca la producción de ROS y disfunción mitocondrial [50]. Además, varios estudios han demostrado que los compuestos que provocan una alteración de ΔΨm y una alta producción de ROS podrían provocar una alteración de la producción de ATP en los parásitos [30, 37, 39, 51]. Además, los compuestos que ejercen una alta producción de ROS y la despolarización de la membrana mitocondrial conducen a la peroxidación de ácidos grasos de cadena larga y a la producción de intermediarios tóxicos, como hexanal, aldehído y alquenos en las células huésped y en las células parásitas, lo que resulta en actividades apoptóticas y eventualmente en la muerte celular. 52, 53]. Observamos una diferencia estadística entre los tratamientos con QUE, H2O2 (control positivo) y medio solo (control negativo). Confirmando los resultados de estudios previos informados en Lesihmania spp, utilizando QUE, nuestro estudio actual mostró una diferencia estadística entre el control positivo estándar (50 µM H2O2) versus 0,62 µM QUE (p < 0,001), 16,67 µM QUE versus 0,62 µM QUE (p < 0,001), medio versus 50 µM H2O2 y 16,67 µM QUE versus 0,62 µM QUE (p < 0,001). Curiosamente, se observó que la CI50 de QUE sola y en combinación con AZ era efectiva en concentraciones submicrolares, lo que contrasta con los resultados informados para Leishmania spp. [50]. Esta diferencia podría atribuirse a los tipos de células huésped utilizadas como medio de propagación de los parásitos, la concentración de QUE y/o la cantidad de parásitos utilizados. También se ha informado que QUE es altamente antiinflamatorio y antioxidante, y estas propiedades se han asociado con su inhibición oxidativa, quinasa y del ciclo celular [54]. Los estudios también han demostrado su capacidad para inducir la apoptosis en células cancerosas [55]. Nuestro trabajo anterior utilizando dihidroquercetina mostró una inhibición de T. gondii pero no tan efectiva como QUE [32], posiblemente debido en parte a la cantidad de grupos hidroxilo disponibles en QUE y el análogo dihidroquercetina.

a La quercetina altera el potencial de membrana de las mitocondrias (MMP) en los taquizoitos extracelulares de T. gondii. Las flechas blancas indican parásitos. El panel rojo representa la MMP no comprometida en parásitos y el panel verde indica la MMP comprometida en parásitos tratados con Que (0,62 y 16,67 µM) y un compuesto estándar (CCCP) a 50 µM. El verde indica MMP comprometido. Barra de escala: 200 µm. b Que altera la MMP en taquizoitos intracelulares de T. gondii. Las flechas blancas pequeñas indican parásitos y las puntas de flecha cortas y grandes indican células huésped. Las puntas rojas indican mitocondrias intactas en taquizoítos tratados con Que (0,62 y 16,67 µM) y un compuesto estándar CCCP a 50 µM. El verde indica el MMP comprometido. Barra de escala: 200 µm. CCCP, cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona; Que, quercetina

La quercetina altera la producción de ATP en los taquizoitos extracelulares de T. gondii. QUE, quercetina. ** y *** indica una diferencia estadística entre tratamientos en p < 0,01 y p < 0,001 respectivamente

La quercetina induce la producción de ROS en taquizoitos intracelulares de T. gondii. H2O2, peróxido de hidrógeno; QUE, quercetina; ROS, especies reactivas de oxígeno. * indica p < 0,05

En conclusión, encontramos que QUE inhibía el crecimiento de taquizoitos y también causaba alteración del potencial de la membrana mitocondrial, agotamiento de ATP y aumento de la producción de ROS. Cualquier alteración de los orgánulos podría afectar directa o indirectamente la energía y muchas otras vías, dependiendo de las vías dirigidas por las mitocondrias. Comparativamente, la terapia combinada (AZ + QUE) fue más eficaz contra la proliferación de parásitos en una proporción de 2:1 (QUE:AZ) que cada uno de los compuestos individuales por separado. Esto implica que QUE podría ser un buen candidato para una futura combinación con AZ. Las pruebas in vivo para determinar su eficacia y seguridad serán una investigación apasionante y necesaria.

Todos los datos se han incluido en el manuscrito y los datos sin procesar están disponibles previa solicitud.

Azitromicina

Concentración inhibidora media máxima

quercetina

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Descargar referencias

Los siguientes reactivos se obtuvieron a través del Repositorio de recursos de investigación de infecciones emergentes y biodefensa de los NIH, recursos de NAID, NIH y BEI: células Vero Kidney (mono verde africano), que expresan luciferasa (Luc2p); Células renales NR-10385 MDCK. La línea celular RH-(YFP)2 fue proporcionada amablemente por el Prof. William H. Witola de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Illinois, Urbana-Champaign, IL, EE. UU. Nos gustaría agradecer a Bernard BA Efa por el transporte de las placas para el trabajo de microscopía.

No se proporcionó financiación externa. El trabajo fue apoyado por la Universidad Estatal de Alabama a través del Departamento de Ciencias Biológicas en la división del programa de doctorado en Microbiología.

Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Tecnología, Ingeniería y Matemáticas, Universidad Estatal de Alabama, Montgomery, AL, 36104, EE. UU.

Daniel A. Abugri, Sandani VT Wijerathne, Homa Nath Sharma, Joseph A. Ayariga, Audrey Napier y Boakai K. Robertson

Programa de Doctorado en Microbiología, Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Tecnología, Ingeniería y Matemáticas, Universidad Estatal de Alabama, Montgomery, AL, 36104, EE. UU.

Daniel A. Abugri, Sandani VT Wijerathne, Homa Nath Sharma y Boakai K. Robertson

Laboratorio de Etnomedicina, Parasitología y Descubrimiento de Fármacos, Facultad de Ciencias, Tecnología, Ingeniería y Matemáticas, Universidad Estatal de Alabama, Montgomery, AL, 36104, EE. UU.

Daniel A. Abugri y Homa Nath Sharma

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DAA concibió la información. SW, JAA, HNS y DAA realizaron los experimentos. JAA, HNS y DAA realizaron las estadísticas. DAA escribió el artículo inicial. JAA, AN y BKR contribuyeron con asesoramiento técnico y recursos, hicieron sugerencias para los enfoques experimentales y leyeron los manuscritos para hacer correcciones.

Correspondencia a Daniel A. Abugri.

El estudio no involucra ningún animal vertebrado.

Todos los autores estuvieron de acuerdo con el contenido del artículo para su publicación.

No hay intereses competitivos.

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Reimpresiones y permisos

Abugri, DA, Wijerathne, SVT, Sharma, HN et al. La quercetina inhibe la proliferación de taquizoitos de Toxoplasma gondii y actúa sinérgicamente con la azitromicina. Vectores de parásitos 16, 261 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05849-3

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Recibido: 09 de febrero de 2023

Aceptado: 26 de junio de 2023

Publicado: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05849-3

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