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Jun 18, 2023

Levadura que carece del esterol C

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 13617 (2023) Cite este artículo 179 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics La escina es una mezcla de más de 30 estructuras triterpenoides (saponinas) glicosiladas,

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13617 (2023) Citar este artículo

179 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

La escina es una mezcla de más de 30 estructuras triterpenoides (saponinas) glicosiladas, extraídas del fruto seco del castaño de indias. La escina se utiliza actualmente como antiinflamatorio y tiene aplicaciones potenciales en el tratamiento de la artritis y el cáncer. La levadura genética permitiría la producción de componentes bioactivos específicos de la escina a escala industrial; sin embargo, se ha demostrado que muchas saponinas son tóxicas para la levadura. Aquí informamos que una cepa de Saccharomyces cerevisiae que carece específicamente del gen de esterol C-5 desaturasa ERG3, exhibe una sorprendente tolerancia mejorada al tratamiento con escina. Los análisis del transcriptoma, así como la premezcla de escina con esteroles, respaldan la hipótesis de que la escina interactúa directamente con el ergosterol, pero no tan fuertemente con los esteroles alterados presentes en erg3Δ. Una amplia gama de saponinas son de interés comercial, y esta investigación destaca el valor de la detección de mutantes de lipidomas para identificar huéspedes apropiados para diseñar la producción industrial de saponinas.

Las saponinas (triterpenoides glicosilados) se encuentran entre los grupos más numerosos y diversos de productos naturales vegetales, con un enorme potencial en muchas industrias1,2. Además de las aplicaciones farmacéuticas como adyuvantes de vacunas3 y antiinflamatorios4, las saponinas también tienen potencial en terapias contra la artritis, la obesidad, el cáncer y la enfermedad de Alzheimer5,6,7. Algunas saponinas también se han utilizado como estabilizadores de espuma y emulsionantes en cosméticos y jabones8. Muchos compuestos de saponina tienen propiedades hemolíticas y, en la naturaleza, generalmente se considera que las saponinas funcionan como compuestos de defensa de las plantas, aunque pocos estudios han investigado el grado y el mecanismo de la actividad antifúngica9,10,11,12,13,14,15,16. Esto es relevante para comprender el papel biológico de las saponinas en las plantas y para la ingeniería de levaduras como fábricas para la producción de saponinas. Si bien la extracción de saponinas de las plantas es estacional y de rendimiento limitado, la levadura puede modificarse fácilmente para expresar genes vegetales, y existe una infraestructura establecida para el cultivo rápido de levadura y la extracción de productos a gran escala. A diferencia de las bacterias, las levaduras tienen retículo endoplásmico (RE) que apoya la actividad de las enzimas del citocromo P450 localizadas en el RE que participan en la biosíntesis de saponina. La producción con levaduras artificiales también permite producir y extraer estructuras de saponinas específicas con gran pureza, a diferencia de las mezclas de saponinas que se extraen de las plantas.

La escina (también denominada escina) es una mezcla de más de 30 estructuras de saponina extraídas del fruto del castaño de indias Aesculus hippocastanum L. Aproximadamente el 60% de la escina es β-escina (Fig. 1a), que comprende una columna vertebral triterpenoide de protoescigenina, esterificada en la posición C-22 con ácido acético, y en la posición C-21 con ácido angelical o tíglico17. La escina tiene potentes propiedades antiinflamatorias y se utiliza en el tratamiento de la insuficiencia venosa crónica, el edema posoperatorio y las hemorroides4,18,19. La escina también es prometedora en el tratamiento de la artritis20,21 y el cáncer; la escina interfiere con los ciclos de las células tumorales, induce la apoptosis de las células cancerosas, inhibe la migración celular y aumenta el impacto de los fármacos de quimioterapia22. Mientras que el castaño de indias proporciona un suministro estacional de una mezcla de saponinas, la levadura genética podría potencialmente permitir la fabricación a escala industrial durante todo el año de componentes activos específicos de este potente terapéutico; sin embargo, previamente se ha demostrado que la escina tiene actividad antifúngica23,24.

(a) Estructura de la β-escina, que comprende aproximadamente el 60% de las saponinas de la escina17. La cadena principal de protoescigenina está esterificada en C-22 con ácido acético y en C-21 con ácido angélico o tíglico (se muestra el ácido tíglico). El ácido glucurónico (GlcA) está conjugado en C-3. Al ácido glucurónico se unen dos azúcares de glucosa (Glc), uno de los cuales puede sustituirse por xilosa (Xyl). (b) Actividad de las enzimas implicadas en las últimas etapas de la biosíntesis de ergosterol, a partir del precursor zimosterol. Las reacciones se representan en la Fig. S1. (c) Crecimiento en cultivos de microplacas indicado por ΔA595 (0–24 h). Tres réplicas biológicas ± desviación estándar (DE).

Se ha informado que muchas saponinas, incluida la escina, interactúan con el esterol colesterol de los mamíferos9,17,25. Nuestra hipótesis es que la escina puede inhibir el crecimiento de hongos mediante la interacción con el ergosterol, que comprende el 12% en moles del lipidoma de S. cerevisiae y es el esterol predominante en la membrana plasmática de la levadura26,27. En apoyo de esto, recientemente se ha demostrado que la suplementación del cultivo de Leptosphaeria maculans con ergosterol alivia la inhibición del crecimiento mediada por el tratamiento con escina24. Además, planteamos la hipótesis de que las cepas de levadura que acumulan esteroles distintos del ergosterol pueden exhibir una mayor tolerancia a la escina. Aquí informamos que una cepa de S. cerevisiae que carece del esterol C-5 desaturasa Erg3 muestra una sorprendente tolerancia mejorada a altas concentraciones de escina, lo que respalda nuestras hipótesis. Por lo tanto, una cepa diseñada que carezca de Erg3 permitiría la producción microbiana de escina saponinas.

Nuestra hipótesis es que si la toxicidad de la escina está mediada por la interacción directa con el ergosterol, entonces los mutantes de la biosíntesis de ergosterol pueden diferir en la tolerancia a la escina. Se considera que los esteroles tienen un papel clave en el mantenimiento de la homeostasis de la dinámica de la membrana plasmática28; sin embargo, las cepas de levadura que carecen de enzimas que catalizan los cinco pasos finales en la biosíntesis de ergosterol (Erg2, Erg3, Erg4, Erg5 o Erg6; Figs. 1b y S1) son viables. Debido a la promiscuidad del sustrato de estas últimas enzimas en la biosíntesis de ergosterol, estos mutantes por deleción acumulan una mezcla de estructuras de esteroles, que difieren del ergosterol en el número y la posición de los dobles enlaces en el anillo B de esterol y en la cadena lateral de esterol29. Utilizamos cultivos en microplacas de la cepa natural BY4741 (WT) y mutantes de Yeast Deletion Collection30, para evaluar el crecimiento de los mutantes de la biosíntesis de ergosterol en medio rico complejo (YPD) en presencia y ausencia de escina (Fig. 1c). La extracción de esteroles y el análisis mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas verificaron que el ergosterol no se acumulaba en las cepas mutantes (Figs. S2 y S3). La concentración inhibidora mínima (CMI) de escina para la cepa WT en medio YPD fue de 150 µg/ml. Se observaron CIM similares para las cepas erg2Δ, erg4Δ, erg5Δ y erg6Δ; sin embargo, el crecimiento de la cepa erg3Δ no se inhibió hasta la concentración más alta probada (1000 µg/ml; Fig. S4).

Para explorar más a fondo el impacto de la escina en las células WT y el mecanismo de tolerancia a la escina en erg3Δ, analizamos los transcriptomas de las células WT, erg3Δ y erg6Δ, tratadas con 0 o 100 µg/ml de escina en YPD durante 1 h, en agitar los cultivos del matraz. La cepa erg6Δ se incluyó en este experimento ya que esta cepa comparte muchos fenotipos similares con erg3Δ29, pero no tiene una mayor tolerancia a la escina (CMI 150 µg/ml; Fig. 1c). Dentro del alcance de este experimento, también analizamos los transcriptomas de las células erg3Δ y erg6Δ que se trataron con 75 µg/ml de escina durante 1 h.

K significa que la agrupación de los 2000 genes con los niveles de expresión más variables se muestra en la Fig. S5, con detalles completos del análisis de enriquecimiento del conjunto de genes incluidos en la Información complementaria (SI). Los genes del grupo B (n = 82) se expresan en general a un nivel más alto en erg3Δ y erg6Δ en comparación con WT en todas las condiciones y, como se anticipó, este grupo está enriquecido en genes relacionados con la biosíntesis de esteroles, el transporte de esteroles, el transporte de sideróforos y la regulación. de transcripción por la glucosa. Los genes del grupo A (n = 821) están regulados negativamente en WT y erg6Δ en respuesta al tratamiento con escina. Este grupo está enriquecido en genes relacionados con la biogénesis de ribosomas y el procesamiento de ARN. Los genes del grupo C (n = 897) y D (n = 200) están en general regulados positivamente en WT y erg6Δ en respuesta al tratamiento con escina, y los genes del grupo D están regulados positivamente en mayor medida que el grupo C. El grupo D está enriquecido en genes relacionados con Metabolismo de trehalosa, manosa, fructosa y glutamato, así como glucólisis y organización de la pared celular. El grupo D también está enriquecido en genes asociados con respuestas al estrés osmótico, oxidativo, térmico y de inanición. El grupo C está enriquecido en genes relacionados con la nucleofagia tardía, el catabolismo lipídico, la asimilación de azufre, el ciclo del ácido tricarboxílico y la gluconeogénesis.

Los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) con una expresión diferencial ≥ 2 veces entre las condiciones de interés (Fig. 2) se analizan con más detalle a continuación, con detalles completos del enriquecimiento del conjunto de genes en SI.

Diagramas de Venn para genes expresados ​​diferencialmente (DEG). Los DEG tienen una expresión diferencial ≥ 2 veces y una tasa de descubrimiento falso (FDR) ≤ 0,1.

La comparación de los transcriptomas de cepas en condiciones de control revela diferencias interesantes entre las cepas mutantes y WT. La eliminación de ERG6 da como resultado un mayor número de DEG (n = 162) que la eliminación de ERG3 (n = 106). En ambos mutantes, los DEG regulados positivamente están enriquecidos en genes relacionados con la biosíntesis y el transporte de esteroles, incluido el sensor de esteroles y el activador transcripcional UPC2 (Fig. S6). Por el contrario, sólo un número muy pequeño de genes implicados en el suministro de esfingolípidos y fosfolípidos están regulados positivamente (YSR3, RSB1, FAA2 y ELO2 en ambas cepas, y además SUR1 en erg6Δ; Fig. S7), aunque se han informado grandes cambios en la composición de los esfingolípidos. para mutantes de biosíntesis de esteroles31.

Los genes de manoproteínas de la pared celular de respuesta anaeróbica también están altamente regulados en ambas cepas (Fig. S8). Varios pasos de la biosíntesis de ergosterol requieren oxígeno y hierro como cofactores, y existe una interacción compleja entre las respuestas reguladoras al ergosterol, el oxígeno y el hierro32,33,34,35. Varios genes de respuesta a la falta de hierro están regulados positivamente en erg6Δ (FIT2, FIT3, ARN2, SIT1, TIS11), pero no en erg3Δ, en relación con WT (Fig. 3a). Recientemente se ha informado que el factor de transcripción Aft1, que normalmente se desplaza entre el citoplasma y el núcleo, se acumula en las vacuolas de las células upc2Δ con disminución de ergosterol37. Nuestros datos sugieren que esta vía de señalización puede verse afectada en diferentes grados en erg6Δ y erg3Δ.

La cepa erg6Δ exhibe una expresión elevada de genes de asimilación de azufre y genes de respuesta a la falta de hierro. Expresión de genes relacionados con (a), la homeostasis del hierro y (b), la vía de biosíntesis de metionina, en condiciones de control, unidades log2 (CPM + 4). Atrevido; gen regulado positivamente ≥ 2 veces en erg6Δ versus WT. Asterisco; gen regulado positivamente ≥ 2 veces en erg3Δ versus WT (FDR ≤ 0,1).

Los genes del metabolismo de la metionina también están regulados positivamente en erg6Δ, pero no en erg3Δ (Fig. 3b). Específicamente, los genes regulados positivamente están asociados con la vía de asimilación de azufre (SUL2, MET3, MET14, MET16, MET5, MET10) y el ciclo del metilo (MET6, SAM2, MHT1) que genera S-adenosilmetionina (SAM) (Fig. S9). . La enzima Erg6 utiliza el donante de metilo SAM para metilar zimosterol38, y previamente se ha descubierto que una cepa deficiente en Erg6 acumula SAM, lo que se atribuyó a un consumo reducido de SAM39.

Ambas cepas regulan a la baja una serie de genes implicados en el apareamiento (Fig. 4). Estos son principalmente genes que están involucrados en la conjugación entre puntas de apareamiento (FUS1, AGA1, AGA2, FIG1, SHC1), y previamente se ha descrito una eficiencia de apareamiento notablemente reducida para mutantes de biosíntesis de ergosterol40,41.

Las cepas erg3Δ y erg6Δ exhiben una expresión reducida de genes de apareamiento. Expresión de genes relacionados con el apareamiento, unidades log2(CPM + 4). Atrevido; regulación negativa ≥ 2 veces en la comparación erg6Δ 0 µg/ml de escina frente a WT 0 µg/ml de escina. Asterisco; regulación negativa ≥ 2 veces en las comparaciones erg3Δ 0 µg/ml de escina frente a WT 0 µg/ml de escina (FDR ≤ 0,1).

Ambas cepas también expresan NCE102 en un nivel más bajo que WT (42% del nivel de WT en erg3Δ y 40% del nivel de WT en erg6Δ). Aunque se localiza principalmente en los eisosomas de la membrana plasmática, recientemente se ha informado que Nce102 tiene un papel en la fusión de vacuolas42, y las vacuolas están muy fragmentadas en muchas cepas mutantes de biosíntesis de ergosterol, incluida erg3Δ, aunque no erg6Δ43,44,45.

Es de destacar que varios DEG entre los mutantes y WT tienen una función desconocida; 20 y 29 DEG regulados positivamente, y 10 y 13 DEG regulados negativamente, en erg3Δ y erg6Δ respectivamente.

En respuesta a 100 µg/ml de escina, las cepas WT y erg6Δ regulan positivamente 473 y 494 genes, respectivamente (Fig. 2b). Estos DEG están enriquecidos en genes que también están asociados con respuestas a la desecación, estrés osmótico, estrés oxidativo, temperatura, tratamiento químico y cambios en los niveles de nutrientes (SI). El tratamiento de células erg6Δ con 75 µg/ml de escina dio como resultado una regulación positiva de 199 genes (Fig. 2c). Estos 199 DEG están enriquecidos en genes asociados con respuestas al estrés oxidativo, al estrés químico y al hambre (SI).

El impacto del tratamiento con escina en los genes del metabolismo central del carbono se muestra en la Fig. S10. En respuesta a 100 μg/ml de escina, tanto WT como erg6Δ regulan fuertemente los genes relacionados con la biosíntesis de trehalosa, glucógeno y glicerol. Se considera que el glucógeno polímero de glucosa funciona principalmente como un carbohidrato de almacenamiento, lo que tiene poco impacto en la presión osmótica interna de la célula46,47. Se considera que el disacárido trehalosa tiene un papel clave en la protección de la estructura de las membranas lipídicas y las proteínas, al desplazar el agua de las bicapas lipídicas y las superficies proteicas, y prevenir la agregación de proteínas desnaturalizadas que impedirían su posterior replegamiento47. El glicerol actúa como un osmolito clave durante el estrés hiperosmótico y forma la columna vertebral de los fosfolípidos y los triacilgliceroles lipídicos de almacenamiento48. La regulación positiva de la biosíntesis de trehalosa, glucógeno y glicerol es parte de una respuesta general al cambio ambiental47,48,49. Además, tanto las cepas WT como erg6Δ regulan positivamente los genes que codifican proteínas del complejo de degradación inducida por glucosa (GID), que regula negativamente la gluconeogénesis, a favor de la glucólisis, al iniciar la poliubiquitinación y la degradación de la fructosa-1,6-bisfosfatasa50 (Fig. S11). .

En respuesta a 100 μg/ml de escina, tanto WT como erg6Δ también regulan positivamente los genes que codifican enzimas de la vía de derivación del ácido γ-aminobutírico (GABA) (Fig. S12) que degrada el glutamato a través de GABA. En la levadura, se ha demostrado que esta vía es importante para la tolerancia al calor y al estrés oxidativo51.

Los DEG regulados positivamente también están enriquecidos en genes relacionados con la organización de la pared celular, incluida la esporulación y la biosíntesis de quitina (Fig. S13). La interferencia entre las vías de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) de glicerol 1 de alta osmolaridad (Hog1) y de integridad de la pared celular (CWI) significa que es difícil analizar tensiones específicas que inician la regulación positiva de estos genes, sin utilizar mutantes que sean defectuosos. en ramas específicas de estas vías de señalización52,53,54.

Muchos genes relacionados con la autofagia están regulados positivamente en WT y erg6Δ en respuesta al tratamiento con escina (Fig. S14), incluidos los componentes centrales del fagosoma y las proteínas involucradas en la vía citoplasma a vacuola, que administra selectivamente hidrolasas a la vacuola55. En respuesta a 100 μg/ml de escina, más genes relacionados con la autofagia están regulados positivamente ≥ 2 veces en la cepa erg6Δ que en WT (11 frente a 7).

La cepa erg6Δ también regula negativamente más genes que WT en respuesta a 100 μg/ml de escina (159 frente a 50), y estos DEG están enriquecidos en genes relacionados con la biogénesis y la traducción de los ribosomas. Estos procesos requieren cantidades sustanciales de energía56, y su regulación negativa es parte de una respuesta general al estrés, en la que los recursos se desvían hacia la resistencia al estrés en lugar de hacia la proliferación celular57,58.

Si la escina secuestrara el ergosterol de las células o inhibiera la detección de esteroles mediante la interacción con el ergosterol o con un sensor de esteroles, entonces podríamos esperar ver un cambio transcripcional en los genes de biosíntesis de esteroles como ERG2 y ERG11 en respuesta al tratamiento con escina. Estos genes están regulados por los sensores de esteroles y activadores transcripcionales Upc2 y Ecm22, en respuesta al contenido de ergosterol59,60. No se observa la expresión diferencial de los genes de biosíntesis de ergosterol (Fig. S6), aunque existe una regulación positiva estadísticamente significativa pero pequeña de UPC2 en cada cepa (1,3, 1,9 y 1,5 veces para WT, erg6Δ y erg3Δ respectivamente). Una pequeña cantidad de genes relacionados con el suministro de esfingolípidos están regulados positivamente en respuesta a la escina en WT y erg6Δ (Fig. S7), aunque cabe señalar que gran parte de la regulación de los esfingolípidos es postraduccional31.

En contraste con los grandes cambios en el transcriptoma observados para las cepas WT y erg6Δ, la cepa erg3Δ regula positivamente solo 19 genes en respuesta a 100 µg/ml de escina y regula negativamente 4 (Fig. S15). La mayoría de estos DEG también se expresan diferencialmente en la cepa WT y/o erg6Δ en respuesta al tratamiento con escina, con la excepción de HAP4 (que codifica un regulador de la respiración), YOL163W (considerado no funcional), YGL088W (función desconocida) y el Genes de manoproteínas de la pared celular DAN1 y DAN4.

Para explorar si los DEG de respuesta a la escina en la cepa WT ya se expresan diferencialmente en erg3Δ en condiciones de control, potencialmente 'preparando' erg3Δ para el estrés del tratamiento con escina, comparamos los DEG en las comparaciones WT 100 versus 0 µg/mL de escina. y erg3Δ 0 µg/mL de escina versus WT 0 µg/mL de escina (Fig. S16a). En condiciones de control, la cepa erg3Δ tiene una expresión elevada de 18 genes que también están regulados positivamente en WT en respuesta al tratamiento con escina, y una expresión más baja de 5 genes que están regulados negativamente en WT en respuesta al tratamiento con escina. En la figura S16b se incluye un mapa de calor que muestra los niveles de expresión de estos genes superpuestos. La mayoría de estos genes también están regulados diferencialmente en la cepa erg6Δ en condiciones de control, y la cepa erg6Δ no exhibe el fenotipo de tolerancia mejorada a la escina. Las excepciones son PAI3 (que codifica un inhibidor de la proteinasa A citoplasmática), SRL3 (que codifica un regulador del ciclo celular), HED1 (que codifica una proteína específica de la meiosis), MAL31 (que codifica una permeasa de maltosa), ARG3 (que codifica una ornitina carbamoiltransferasa), COS111 (que codifica una proteína mitocondrial), los genes YBR090C y YKR075C de función desconocida, y los genes YJR037W y YJL195C que es poco probable que codifiquen proteínas funcionales.

En general, estos datos muestran que la escina no tiene ningún impacto sobre el crecimiento y un impacto insignificante sobre el transcriptoma de las células erg3Δ. No es probable que esto se deba a que las células erg3Δ ya estén preparadas para el estrés inducido por el tratamiento con escina, y es potencialmente atribuible a la composición química de los esteroles de su membrana.

Para explorar la hipótesis de que la escina media la toxicidad al interactuar directamente con el ergosterol, pero no con los esteroles alterados presentes en erg3Δ, evaluamos el impacto del tratamiento de las células WT con escina sola o escina premezclada con ergosterol en un 1 :1 relación molar. Se consideró que si el ergosterol interactúa directamente con la escina, entonces una mezcla de escina y ergosterol tendría un impacto reducido en el crecimiento de la WT que la escina sola, debido a la accesibilidad reducida de las saponinas de la escina. En particular, las células de levadura no importan esteroles exógenos en condiciones aeróbicas37.

El experimento se llevó a cabo utilizando cultivos en microplacas y medios de mezcla completa de suplementos (CSM), a diferencia de YPD, ya que se define el contenido exacto de CSM, mientras que YPD es un medio rico que contiene moléculas complejas de extracto de levadura, que también pueden interactuar con la escina. y/o esteroles. Estudios anteriores han informado que el ergosta-7,22-dienol es el esterol predominante en la levadura que carece de Erg3, y que también se acumulan episterol y ergosta-7-enol31,43. Cuando se verificó el contenido de esteroles mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (Figs. S2 y S3), el tiempo de retención relativo del pico de esterol más grande en el cromatograma de iones totales erg3Δ correspondió a informes anteriores para ergosta-7,22-dienol, cuando la cepa se cultivó en YPD o CSM.

Se determinó que la CIM de escina en medio CSM era 63 μg/ml para células WT (Fig. 5b); 2,4 veces menor que en YPD. Mientras tanto, el crecimiento de la cepa erg3Δ se desinhibió hasta la concentración más alta probada (500 μg/ml). Cuando la escina se premezcló con ergosterol en una proporción molar de 1:1 y la mezcla se agregó a las células, el crecimiento de la cepa WT en presencia de 63 μg/ml de escina se restableció por completo (Fig. 5c). La premezcla de escina con ergosterol también restauró el porcentaje de células teñidas con el tinte impermeable a la membrana yoduro de propidio para controlar los niveles de tratamiento (Fig. S17), lo que indica una disminución de la permeabilidad celular y/o una mayor viabilidad celular.

Restauración del crecimiento cuando la escina se premezcla con ergosterol, pero no con brasicasterol. (a) Estructura del ergosterol (el esterol predominante en la membrana plasmática de S. cerevisiae), el brassicasterol (un esterol vegetal) y los esteroles que se han identificado como acumulativos en la cepa erg3Δ (episterol, ergosta-7,22-dienol, ergosta- 7-enol). (b) y (c), crecimiento en cultivos de microplacas indicado por ΔA595 (0–24 h). Tres réplicas biológicas ± desviación estándar (DE). En (b), la CIM de la escina en medios CSM es de 63 μg/ml para WT, que es 2,4 veces menor que en un medio complejo rico. En (c), las células WT se cultivaron en presencia de 0 o 63 μg/ml de escina (1,25 % de metanol), sola o premezclada con ergosterol o brasicasterol en una proporción molar de 1:1. Se incluyeron controles únicamente de ergosterol y brasicasterol. Estadística: ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Tukey HSD, las condiciones no conectadas por la misma letra son significativamente diferentes (p ≤ 0,05).

Los esteroles presentes en erg3Δ son de disponibilidad limitada, por lo que, a modo de comparación, también evaluamos el crecimiento cuando la escina se premezcló con el fitosterol brassicasterol, que también tiene un doble enlace en el anillo B, aunque la posición de este es entre C- 5 y C-6 (Fig. 5a). En contraste con el crecimiento restaurado observado cuando se premezcló escina con ergosterol, no se observó restauración del crecimiento WT cuando se premezcló escina con brasicasterol en una proporción molar de 1: 1 (Fig. 5c).

Esto respalda la hipótesis de que la escina interactúa directamente con el ergosterol y que pequeños cambios en la estructura de los esteroles pueden tener un gran impacto en la fuerza de las interacciones esterol-saponina.

Las saponinas son un grupo diverso de productos naturales vegetales de alto valor, con un enorme potencial en muchas industrias. Un aumento reciente en la identificación de genes vegetales involucrados en la biosíntesis de saponinas ha permitido la ingeniería de levaduras para la producción de saponinas61; sin embargo, se sabe que muchas saponinas, incluida la escina, tienen actividad antifúngica y/o un efecto lítico sobre los glóbulos rojos y las membranas sintéticas9, 23,25,62,63. Por lo tanto, es probable que algunas saponinas inhiban el crecimiento de la levadura, particularmente en concentraciones altas, lo que limitaría la productividad. Aquí, exploramos el impacto de la mezcla de saponinas escina en las células de levadura, ya que la escina tiene potentes propiedades terapéuticas4, y la producción de saponinas de escina específicas en la levadura facilitaría la biosíntesis y la purificación rentables de componentes bioactivos a escala industrial.

Informamos que la CIM de escina para levadura WT es de 150 μg/mL en medio rico indefinido (YPD) y de 63 μg/mL en medio sintético definido (CSM). Además del medio YPD más rico que contiene precursores complejos de muchos procesos biosintéticos, estos medios difieren en el contenido de carbono, la capacidad amortiguadora y la osmolaridad64. Es probable que estas diferencias contribuyan a la diferencia en el MIC observada.

Para investigar la hipótesis de que la escina inhibe el crecimiento de la levadura mediante la interacción con el ergosterol, evaluamos el impacto de la escina en el crecimiento de mutantes en la biosíntesis de ergosterol. Identificamos que la escina tiene un impacto insignificante en el crecimiento del mutante erg3Δ de esterol C-5 desaturasa. También hubo poco impacto en el transcriptoma de las células erg3Δ en respuesta al tratamiento con escina. Por el contrario, hay grandes cambios en el transcriptoma en las células WT y erg6Δ en respuesta al tratamiento con escina, y los procesos regulados positivamente corresponden a los inducidos en respuesta al estrés osmótico, oxidativo, de temperatura y de inanición. Debido al cruce entre las vías de señalización del estrés52,53,54, la perturbación inicial específica que induce la respuesta del transcriptoma no puede identificarse utilizando únicamente los datos del transcriptoma. Una comparación entre los genes que se expresan diferencialmente en la cepa WT en respuesta al tratamiento con escina y los genes que se expresan diferencialmente en la cepa erg3Δ en comparación con WT en condiciones de control, indica que el transcriptoma erg3Δ no está "preparado" para el estrés de la escina. tratamiento. El hallazgo de que la mezcla previa de escina con ergosterol en una proporción molar de 1:1 alivia el impacto inhibidor del crecimiento de la escina en las células WT respalda la hipótesis de que la toxicidad de la escina para la levadura está mediada por la interacción directa entre las saponinas de la escina y el ergosterol.

Recientemente se han revisado los fenotipos de los mutantes viables de la biosíntesis de ergosterol y su relevancia para las fábricas de células de levadura29. Los mutantes en la biosíntesis de ergosterol suelen ser más susceptibles al tratamiento antifúngico que las células WT29. Esto se ha atribuido al aumento de la permeabilidad de la membrana, la hiperpolarización de la membrana plasmática y la reducción de la actividad de las bombas de eflujo como Pdr5p en las células mutantes, lo que da como resultado una mayor acumulación intracelular de fármacos antifúngicos29. Una excepción a esto es la mayor tolerancia al fluconazol de las cepas de Candida albicans que carecen de la enzima C. albicans Erg329. El fluconazol inhibe la enzima lanosterol 14-α-desmetilasa Erg11, lo que resulta en la acumulación de 14α-metilergosta8-24(28)dienol en células con Erg3 funcional y 14α-metil-fecosterol en células que carecen de actividad Erg3. Se ha planteado la hipótesis de que el 14α-metilergosta8-24(28)dienol es perjudicial para las células de C. albicans65.

Los mutantes de la biosíntesis de ergosterol también exhiben diversos grados de tolerancia mejorada a los antifúngicos poliénicos nistatina y anfotericina B29. La nistatina se une al ergosterol en liposomas sintéticos, formando poros en altas concentraciones66, mientras que la anfotericina B secuestra el ergosterol en agregados de la superficie celular67. Es posible que los esteroles presentes en las cepas mutantes no interactúen tan fuertemente con la nistatina y la anfotericina B como lo hace el ergosterol. Además, las células erg6Δ de S. cerevisiae exhiben una mayor tolerancia al glicoalcaloide esteroide α-tomatina, mientras que las células erg3Δ exhiben una mayor tolerancia a la tomatidina (la aglicona de la α-tomatina)68. Se ha informado que el glicoalcaloide esteroide α-tomatina aumenta la permeabilidad de las vesículas sintéticas mediante la interacción con esteroles69 y, nuevamente, es plausible que la α-tomatina y la tomatidina interactúen con los esteroles presentes en erg6Δ y erg3Δ con menor afinidad que el ergosterol.

Recientemente, se ha estudiado el impacto de la escina en membranas modelo sintéticas mediante calorimetría diferencial de barrido, dispersión de rayos X de ángulo amplio, dispersión de rayos X de ángulo pequeño y dispersión de neutrones de ángulo pequeño. Estos estudios indican que la escina aumenta la rigidez de las bicapas de fosfolípidos de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) por debajo de la temperatura de fusión del DMPC y aumenta la fluidez de las bicapas de DMPC por encima de la temperatura de fusión del DMPC17,62,63. El efecto suavizante de la membrana probablemente se deba a las interacciones del grupo de cabeza entre el componente glucósido de la escina y el componente fosfocolina del DMPC, mientras que se propone que el efecto endurecedor se deba a la incorporación de la estructura rígida triterpenoide de las saponinas de la escina en la bicapa lipídica17. Cuando se incluye colesterol en las bicapas de DMPC, se forman fuertes complejos entre el colesterol y las saponinas de escina, lo que reduce la cantidad de escina libre disponible para interactuar con la membrana de fosfolípidos y da como resultado la deformación de pequeñas vesículas unilaminares25. Es posible que las saponinas de escina también interactúen con el ergosterol y afecten de manera similar a la dinámica y organización de la membrana plasmática. Esto podría inducir la formación de poros, alterar la estabilidad de la membrana plasmática y/o afectar la organización lateral y la actividad de los lípidos y proteínas de la membrana plasmática.

El hallazgo de que la premezcla de escina con ergosterol alivia el impacto inhibidor de la escina, mientras que la premezcla con brasicasterol no lo hace, y que los mutantes erg3Δ exhiben una mayor tolerancia al tratamiento con escina, mientras que erg2Δ, erg4Δ, erg5Δ y erg6Δ no, resalta que los pequeños Los cambios en la estructura de los esteroles y, posiblemente, de las saponinas, pueden tener un gran impacto en la bioactividad de las saponinas. La alteración del gen ERG3 de la desaturasa C-5 es una estrategia de ingeniería prometedora para la producción de saponinas de escina en levaduras genéticamente modificadas. Las cepas con diferentes lipidomas pueden exhibir una mayor tolerancia a otras estructuras de saponina y, en general, esta investigación demuestra que la detección de la tolerancia al producto de los mutantes de lipidomas debería ser un requisito previo crucial para la ingeniería de cepas de levadura para la producción de saponinas.

Este estudio utilizó Saccharomyces cerevisiae BY4741 como cepa de fondo de tipo salvaje y mutantes de deleción de Yeast Deletion Collection30. medios YPD; 10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona, 20 g/L de glucosa. medios del MSC; 6,7 g/L de base nitrogenada de levadura (Sigma Y0626), 790 mg/L de mezcla de suplemento completo (Formedium DCS001), 20 g/L de glucosa.

Las células de cultivos nocturnos se lavaron en agua estéril y se inocularon en placas de 96 pocillos (Thermo Scientific #167008), en volúmenes de cultivo de 100 µL, con una DO600 inicial de 0,2 (equivalente a A595 0,04 en el lector de placas). Las placas se incubaron en lectores de placas Tecan Sunrise a 30 °C, con un nivel de agitación "normal". Para evaluar el crecimiento se registró A595, que se correlaciona con la densidad celular.

Se inocularon cepas de levadura en medios YPD o CSM a OD600 0,25 y se incubaron durante 24 h (30 °C, 200 rpm). Luego, la densidad celular de cada cultivo se ajustó a OD600 2,7 y se recogieron aproximadamente 36,9 x 106 células (de 1,5 ml de cultivo) mediante centrifugación y se lisaron en 500 µl de tampón de lisis (KOH al 20%, etanol al 50%, coprostanol 80 nM). ) durante 10 min (100 °C). Los esteroles se extrajeron en 500 µl de hexano tres veces. Se reunieron las fases orgánicas y se evaporó 1 ml hasta sequedad usando un evaporador GeneVac EZ-2 Elite. Las muestras se trimetilsililaron con 50 µl de piridina:N-metilsililtrifluoroacetamina (1:4) directamente antes de la cromatografía de gases y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (GC/QTOF-MS). Los detalles completos de GC/QTOF-MS se incluyen en SI.

Se utilizaron cultivos nocturnos en medio YPD para inocular 20 ml de YPD en matraces cónicos de 100 ml a una DO600 de 0,1. Los cultivos se cultivaron (30 °C, agitación a 200 rpm) hasta la fase logarítmica media y luego se trataron con 0, 75 o 100 µg/ml de escina en agua durante 60 minutos. Se congelaron muestras de sedimentos celulares de aproximadamente 2 × 107 células en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C antes de la extracción de ARN. Para conocer los métodos de extracción, secuenciación y análisis de datos de ARN, consulte Información complementaria. La secuenciación del ARN se llevó a cabo en el Centro de Investigación Genómica de la Universidad de Liverpool.

Para preparar portaobjetos con cámara (Ibidi 80807), se pipetearon 100 µl de 2 mg/ml de concanavalina A (Sigma C2010) en cada pocillo, se incubaron durante 30 segundos y se aspiraron. Luego se lavaron los pocillos con agua tres veces. La levadura se cultivó hasta una DO600 de 0,4 en medio CSM y se transfirieron 400 µl a cada pocillo. Después de 5 minutos, se aspiró el cultivo, se lavaron los pocillos tres veces con medio de tratamiento (400 µl de PBS, metanol al 1,25 %, concentraciones variables de escina) y se incubaron durante 1 h (30 °C, 200 rpm, oscuridad). Luego, las células se lavaron tres veces con 400 µl de PBS que contenía 5 µg/ml de PI (Invitrogen P3566), se incubaron durante 20 minutos (30 °C, 200 rpm, oscuridad), se lavaron tres veces con 400 µl de PBS y se tomaron imágenes en un Leica DMi8. microscopio invertido (540-580/592-668 ex/em).

En los archivos complementarios se incluyen figuras, métodos y detalles complementarios de los genes expresados ​​diferencialmente y los resultados del enriquecimiento del conjunto de genes. Los datos de secuenciación de ARN están disponibles en el Archivo Europeo de Nucleótidos (Número de acceso al proyecto PRJEB61952).

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Este trabajo fue financiado por subvenciones otorgadas por el Centro de Innovación en Biotecnología Industrial (Proyecto IBioIC-2016-150) y el Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (Proyecto BBSRC BB/S017712/1 y Proyecto IBCatalyst No. 102297), y un Proyecto Industrial BBSRC IBioIC. Beca CASE CSV con Unilever. La secuenciación del ARN se llevó a cabo en el Centro de Investigación Genómica de la Universidad de Liverpool. Los autores agradecen al Dr. Marcus Price (Universidad de Edimburgo) y al Prof. Klaus Suhling (King's College London) sus comentarios sobre el manuscrito.

Centro de Ingeniería Biológica, Universidad de Edimburgo, Edimburgo, EH9 3BD, Reino Unido

Emily J. Johnston, Jess Tallis y Susan J. Rosser

Departamento de Biología de Infecciones y Microbiomas, Instituto de Infecciones, Ciencias Veterinarias y Ecológicas, Universidad de Liverpool, Liverpool, L69 7ZB, Reino Unido

Edward Cunningham-Oakes

EdinOmics, RRID:SCR_021838, Universidad de Edimburgo, Max Born Crescent, Edimburgo, EH9 3BF, Reino Unido

Teresa Moisés

División de Ciencias Genéticas, Thermo Fisher Scientific, 7 Kingsland Grange, Warrington, Cheshire, WA1 4SR, Reino Unido

Simón J. Moore

Unilever R&D Port Sunlight, Quarry Road East, Bebington, Wirral, CH63 3JW, Reino Unido

Sara Hosking

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EJJ: conceptualización, investigación, interpretación de datos, preparación de manuscritos. JT: investigación, interpretación de datos. ECO: interpretación de datos. TM: investigación, interpretación de datos, supervisión. SM: investigación, interpretación de datos. SH: conceptualización, interpretación de datos, supervisión. SJR: conceptualización, interpretación de datos, supervisión.

Correspondencia a Emily J. Johnston o Susan J. Rosser.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Johnston, EJ, Tallis, J., Cunningham-Oakes, E. et al. Las levaduras que carecen del esterol C-5 desaturasa Erg3 son tolerantes al antiinflamatorio triterpenoide saponina escina. Informe científico 13, 13617 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40308-0

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Recibido: 10 de mayo de 2023

Aceptado: 08 de agosto de 2023

Publicado: 21 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40308-0

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