Blog

Nov 22, 2023

NPM promueve la hepatotoxina

Cell Death & Disease volumen 14, Número de artículo: 575 (2023) Citar este artículo Detalles de las métricas La fibrosis hepática es causada por una variedad de lesiones hepáticas crónicas y ha causado una morbilidad y

Cell Death & Disease volumen 14, número de artículo: 575 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

La fibrosis hepática es causada por una variedad de lesiones hepáticas crónicas y ha causado una morbilidad y mortalidad significativas en el mundo con una tendencia creciente. El esclarecimiento del mecanismo molecular de la fibrosis hepática es la base para la intervención de este proceso patológico y el desarrollo de fármacos. La nucleofosmina (NPM) es una proteína nucleolar fosforilada ampliamente expresada, que es particularmente importante para la proliferación, diferenciación y supervivencia celular. Aún se desconoce el papel biológico de la NPM en la fibrosis hepática. Aquí mostramos que la NPM promueve la fibrosis hepática a través de múltiples vías. Nuestro estudio encontró que la NPM estaba regulada positivamente en los tejidos de cirrosis y activada en las células estrelladas hepáticas (HSC). La inhibición de NPM redujo la expresión de los marcadores de fibrosis hepática en las HSC e inhibió la proliferación y migración de las HSC. En el modelo de ratones, la eliminación de NPM en las HSC o la aplicación de un inhibidor específico de NPM puede atenuar notablemente la fibrosis hepática. El análisis mecanicista mostró que la NPM promueve la fibrosis hepática al inhibir la apoptosis de las HSC a través de la vía Akt/ROS y al regular positivamente el TGF-β2 a través del lncMIAT inducido por Akt. LncMIAT aumentó el ARNm de TGF-β2 al esponjar competitivamente miR-16-5p. En respuesta a la lesión hepática, los hepatocitos, las células de Kupffer y las HSC regulan positivamente la NPM para aumentar la secreción de TGF-β2 y activar las HSC de forma paracrina o autocrina, lo que conduce a un aumento de la fibrosis hepática. Nuestro estudio demostró que la NPM regulaba la fibrosis inducida por hepatotoxina a través de la apoptosis de HSC inducida por Akt/ROS y a través del TGF-β2 regulado por Akt/lncMIAT. La inhibición de NPM o la aplicación del inhibidor de NPM CIGB300 atenuó notablemente la fibrosis hepática. La NPM sirve como posible nuevo objetivo farmacológico para la fibrosis hepática.

La fibrosis hepática comúnmente resulta de múltiples lesiones hepáticas y se ha convertido en una de las principales causas de enfermedades y muertes relacionadas con el hígado en todo el mundo [1]. Se necesita con urgencia un tratamiento eficaz para la fibrosis hepática. Sin embargo, el mecanismo de la fibrosis no se ha determinado completamente, lo que limita el desarrollo de fármacos antifibrosis. Hasta el momento no se ha aprobado ningún medicamento contra la fibrosis.

La fibrosis hepática involucra una variedad de células como las células estrelladas hepáticas (HSC), hepatocitos, macrófagos, células endoteliales y colangiocitos. Las HSC son los principales efectores de la fibrosis [2, 3]. Las HSC se encuentran en el espacio intersticial entre las células endoteliales de los senos nasales y las células epiteliales hepáticas y representan entre el 5% y el 8% de las células del tejido hepático. Las HSC están inactivas en un hígado sano normal [4]. En respuesta a una lesión hepática, las HSC inactivas se activan por factores inflamatorios o estrés oxidativo persistente debido a un microambiente hepático alterado [5, 6]. Las HSC activadas exhiben características de proliferación y migración y se transforman en células similares a miofibroblastos [7], secretan grandes cantidades de colágeno y matriz extracelular y causan fibrosis hepática. Las HSC producen casi el 90% de la matriz extracelular y contribuyen de manera importante a la deposición de colágeno [8, 9].

Los factores que activan las HSC incluyen el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento transformante (TGF-β), el factor de necrosis tumoral y la interleucina (IL) [10]. Entre estos factores, el TGF-β1 es un poderoso factor fibrogénico [11], que es sintetizado principalmente por HSC/miofibroblastos, células de Kupffer, células endoteliales del seno hepático y hepatocitos [12]. La expresión y actividad de las tres isoformas de TGF-β son diferentes en diversas células del hígado [13, 14], y los datos de las isoformas β2 y β3 en enfermedades fibróticas aún son limitados. TGF-β2 y TGF-β3 pueden activarse mediante un mecanismo independiente de integrina con un umbral más bajo que el TGF-β1, y la inhibición de TGF-β2 y/o TGF-β3 alivia la enfermedad fibrótica [15, 16]. Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos que regulan el TGF-β2 en la enfermedad fibrótica.

La nucleofosmina (NPM), una proteína fosforilada del nucleolo, se expresa ampliamente en células en proliferación y participa en una variedad de procesos biológicos celulares [17,18,19]. NPM promueve la proliferación, diferenciación e inhibe la muerte celular programada [20,21,22]. La mayoría de los estudios realizados hasta ahora han investigado la desregulación de NPM en los cánceres, y la alta expresión de NPM se asocia con la progresión tumoral [23, 24]. Considerando que no se ha informado la relevancia entre la NPM y la fibrosis hepática.

En el presente estudio, demostramos que la NPM promueve la fibrogénesis hepática al inhibir la apoptosis de las HSC inducidas por Akt/ROS y regular positivamente el TGF-β2 inducido por Akt/MIAT en las HSC, hepatocitos y células de Kupffer. Además, el inhibidor de NPM dificulta la progresión de la fibrosis hepática en ratones. Por lo tanto, nuestros resultados arrojan más luz sobre el mecanismo molecular de la fibrosis hepática y proporcionan un nuevo objetivo farmacológico potencial para la fibrosis hepática.

Toda la investigación se realizó de acuerdo con las Declaraciones de Helsinki y Estambul, y todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Xiamen. Todos los experimentos y el cuidado de los animales se realizaron según las pautas descritas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

Se obtuvieron ratones C57BL/6 de cinco semanas de edad (machos, peso corporal: 18-20 g) del Centro Experimental con Animales de la Universidad de Xiamen. Para el modelo de ratón tratado con TGF-β2, además de los ratones C57BL/6, el experimento se repitió utilizando el ratón Balb/c, que contiene más HSC y puede mostrar resultados más significativos. La fibrosis hepática se indujo mediante inyección intraperitoneal de tetracloruro de carbono (CCl4, 1 ml/kg de peso corporal, diluido en aceite de maíz, cada 3 días) durante 8 semanas. Se inyectaron por vía intravenosa liposomas acoplados a VA que portaban ARNip (VA-lip-siRNA) en la quinta semana después de la administración de CCl4. Los ARNip que se modificaron químicamente con 2′-OMe y 5′-Chol consisten en una mezcla igual de dos ARNip que se dirigen al ARNm de NPM. Una pequeña cantidad de ARNip utilizados para mostrar rastros se modificó químicamente con 5′-FAM. Se inyectaron aproximadamente 0,7 mg/kg de peso corporal de ARNip cada 3 días. CIGB300 [25] (10 mg/kg de peso corporal, diluido en PBS, dos veces por semana) se inyectó por vía intravenosa en la quinta semana. Se administró el mismo volumen de solución salina y aceite de maíz a los ratones tanto en el grupo de control normal como en el de control con fibrosis. Los ratones de cada grupo fueron sacrificados después de 8 semanas.

Los VA-lip-siRNA que se dirigen a las HSC se prepararon como se describió anteriormente [26] con algunas modificaciones. En el proceso, los liposomas vacíos liofilizados (LipotrustTM EX Oligo, lote n.º HH00301) que contienen lípidos catiónicos se prepararon a una concentración de 1 mM añadiendo agua bidestilada. Para preparar liposomas acoplados a VA que se dirigen a las células estrelladas hepáticas, mezclamos 200 nmol de vitamina A (retinol, Sigma) disuelta en DMSO con 100 µL de suspensiones de liposomas (100 nmol como lípido catiónico) mediante agitación vortex en un tubo de 1,5 ml a 25 °. C. Se añadieron aproximadamente 15 µl de mezcla de ARNip (114,84 µg de ARNip en DDW) a la solución de liposomas acoplados a retinol con agitación a 25 °C. La proporción de ARNip a lípido catiónico fue de 1:11,5 (mol/mol), y la proporción de ARNip a liposoma (peso/peso) fue de 1:1. Cualquier retinol o ARNip libre se eliminó utilizando un tubo de centrífuga de ultrafiltración (concentrador Amicon Ultra 30.000 MWCO, Millipore) mediante centrifugación a 1500 x ga 25 ° C. El material atrapado en el filtro se reconstituyó con PBS para lograr la dosis deseada para uso in vivo.

Para la administración in vivo, se disolvió MK2206 en una solución que contenía DMSO al 10 %, PEG300 al 40 %, Tween-80 al 5 % y solución salina al 45 % y se administró por vía oral a ratones en una dosis de 240 mg/kg. Los imitadores de miR-16-5p y los imitadores de NC se prepararon en complejos VA-lip-RNA mediante el mismo método que el complejo VA-lip-siNPM descrito anteriormente, y luego se inyectaron en ratones a través de la vena de la cola a una dosis de 0,7 mg/l. kilogramos, respectivamente.

Las matrices de tejido del espectro de la enfermedad hepática humana (Lote No. LV20812a y LV805c) se obtuvieron de US Biomax, Inc. Los tejidos de hígado de ratón fijados con paraformaldehído se deshidrataron y se incluyeron en parafina. Los tejidos del hígado de diferentes ratones se dispusieron en los mismos bloques de parafina y se seccionaron en matrices de tejidos. Estas matrices de tejido se tiñeron con hematoxilina-eosina convencional o rojo Sirius y se fotografiaron bajo un microscopio. Para el análisis inmunohistoquímico (IHC), después de la desparafinación de rutina y la reparación del antígeno, la matriz de tejido se incubó con peróxido de hidrógeno al 3% para inactivar la peroxidasa endógena. Después de bloquear con BSA al 5% en PBS e incubar con anticuerpos a 4 °C durante la noche, al día siguiente se añadió IgG-HRP anti-conejo de oveja (MXB Biotech, Fujian) y las muestras se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. . Se utilizó diaminobencidina para el desarrollo del color. Después de la reacción de color, se usó hematoxilina para el teñido nuclear, alcohol en gradiente para la deshidratación y resina neutra para el sellado de láminas.

Para el análisis IHC múltiplex fluorescente (mIHC), después de la incubación con HRP-IgG, se añadió el reactivo de amplificación TSA®Plus conjugado con fluoróforo y la mezcla se incubó durante 10 minutos. Los protocolos mIHC de CST Company se utilizaron como base para los procedimientos específicos. La sección se selló con reactivo antifade ProLong Gold antes de la observación mediante microscopía confocal.

Se aislaron células primarias del tejido hepático de ratones Balb/c de entre 6 y 8 meses mediante el método convencional. En el proceso, los ratones fueron anestesiados con hidrato de cloral al 10% y sumergidos en alcohol al 70% durante 5 s, y se abrió el abdomen después de fijar las extremidades. Se inyectaron sucesivamente en el hígado soluciones de EGTA, colagenasa P (Roche) y pronasa E (Roche) a través de la vena porta. Después de la perfusión, el tejido hepático se trituró y se preparó en suspensión celular, y la muestra se digirió con una solución enzimática (que incluye colagenasa P, pronasa E y DNasa I) en un baño de agua a 37 °C durante 15 minutos. Después de la digestión, la suspensión celular se pasó a través de un filtro celular de 70 µm y se centrifugó (250 g, 10 min) para obtener el precipitado celular.

Para el aislamiento primario de HSC, las células suspendidas se centrifugaron (900 g, 15 min, 4 °C) a un gradiente de densidad con solución Percoll al 15% y al 35%. La capa de HSC se recogió y se inoculó en una placa de cultivo celular con medio D10. Después de 2 h, se eliminó el medio que contenía células no adherentes y las células adherentes restantes se cultivaron con medio D10. La pureza celular se identificó mediante el método de inmunofluorescencia α-SMA.

Para el aislamiento primario de células de Kupffer, las células suspendidas se centrifugaron (500 g, 15 min, 4 °C) a un gradiente de densidad con solución de Percoll al 25% y al 50%. La capa de células de Kupffer se recogió y se inoculó en una placa de cultivo celular. Después de 2 h, se eliminó el medio que contenía células no adherentes. La pureza celular se identificó mediante el método de inmunofluorescencia F4/80.

Se cortó tejido hepático de un ratón en bloques de tejido de aproximadamente 1 mm³ con un bisturí quirúrgico. Los bloques de tejido se lavaron con 30 ml de PBS preenfriado y se centrifugaron a 50 g durante 1 min para eliminar los glóbulos rojos del sobrenadante. Los bloques de tejido se enzimolizaron con 15 ml de solución digestiva a 37 °C durante 30 min, agitando de vez en cuando. La solución enzimática se prepara con DMEM, que contiene colagenasa tipo IV (1 mg/ml), proteasa de Streptomyces (1 mg/ml), DNasa I (20 µg/ml) y FBS al 2 %. La suspensión unicelular después de la hidrólisis enzimática se pasó a través de un filtro celular con un tamaño de poro de 70 µm en un tubo de centrífuga de 50 ml y se añadió solución de PBS preenfriada (que contenía 0,5 % de EGTA) a 40 ml para terminar la digestión enzimática. La suspensión celular se centrifugó a 4 °C, 800 g durante 5 min y se aspiró el sobrenadante. Se agregaron 10 ml de tampón de lisis ACK preenfriado al precipitado celular para suspensión y dos minutos después se agregaron 40 ml de PBS preenfriado. Después de la centrifugación, se aspiró el sobrenadante para eliminar los glóbulos rojos.

Se añadió 1 ml de PBS al precipitado celular y se suspendió completamente en una suspensión unicelular (aproximadamente 3 ml), que se dividió uniformemente en dos partes. Se añadió la suspensión celular I con la sonda ROS DCFH-DA hasta una concentración final de 5 µM y se incubó en oscuridad a 37 °C durante 30 min. Mientras que el marcaje con ROS se realizó en la suspensión celular I, las células estrelladas hepáticas se aislaron y marcaron en la suspensión celular II. Se centrifugaron 1,5 ml de suspensión celular II a 800 g durante 2 min y se aspiró el sobrenadante. Se añadió una solución de separación en gradiente de Nycondens al 12 % (densidad de aproximadamente 1,055-1,080 g/ml) preparada por GBBS a la precipitación celular hasta un volumen de 13 ml y se suspendió completamente en una solución unicelular. Se agregaron cuidadosamente aproximadamente 2 ml de D-Hanks (que contenía 2% de FBS) a la superficie superior del líquido a lo largo de la pared del tubo. Centrifugar con rotor horizontal a 1350 g durante 10 min. Se recogieron las células en la solución de D-Hanks y en la interfaz de las dos soluciones, se lavaron con 5 veces el volumen de D-Hanks (que contenía FBS al 2%), se centrifugaron a 600 g durante 5 minutos y se aspiró el sobrenadante. Las células precipitadas anteriores separadas de la suspensión celular II son HSC, que además se marcan con el kit de detección de apoptosis anexina V-FITC (Beyotime, lote n.º C1062L). Mientras se marcan las células apoptóticas, las HSC marcadas con sondas ROS se pueden separar de la suspensión celular I utilizando el método descrito anteriormente. Todo el proceso dura unos 110 minutos, lo que preserva al máximo la actividad de las células y el estado fisiológico in vivo. Las HSC marcadas y aisladas se detectaron mediante citometría de flujo para ROS y apoptosis, respectivamente.

La línea HSC humana LX-2 se obtuvo de BeNa Culture Collection de China y fue identificada por Genetic Testing Biotechnology Corporation (Suzhou, China) mediante el uso de marcadores de repetición en tándem cortos. La línea CSFC-2G de HSC de rata fue donada por el Dr. Honghua Zheng de la Universidad de Xiamen. Las líneas celulares de cáncer de hígado humano HepG2 y SK-HEP-1 y la línea de células T 293 de riñón embrionario humano se obtuvieron del Banco de Células de los Institutos de Ciencias Biológicas de Shanghai de China. Estas líneas celulares se cultivaron en DMEM (Gibco, Cat#12800-017) que contenía suero bovino fetal al 10% (PAN, Cat#ST30-3302). La línea celular THP-1 se cultivó en medio RPMI-1640 (BasalMedia, Cat#L210K). Los medicamentos involucrados en este estudio incluyen TGF-β1 (PeproTech, Cat#100-21-10), TGF-β2 (Novoprotein, Cat#CJ79-50), inhibidor de NPM CIGB300 (Royo Biotech, Shanghai), inhibidor de la fosforilación de Akt MK2206 y activador SC79 (Selleck, Cat# S1078, Cat#S7863) y inhibidor de ROS N-acetilcisteína (NAC) (Beyotime, Cat#ST1546). TGF-β1 (10 ng/mL), TGF-β2 (10 ng/mL), CIGB300 (4 y 8 µM), MK2206 (4 y 8 µM), SC79 (4, 8 y 12 µM) y NAC ( 1 y 3 µM) se usaron para el tratamiento celular.

El plásmido pCW-Cas9 y pLX-sgRNA (secuencia objetivo: GCAAGAATCCTTCAAGAAAC) se cotransfectaron en células y la expresión de Cas9 se indujo usando 2 µg/ml de doxiciclina después de 24 h de cultivo. Se agregaron puromicina a 1,5 µg/ml y blasticidina S a 0,85 µg/ml después de 24 h de cultivo. Se observaron comunidades clonales resistentes después del cultivo durante 1 a 2 semanas. En este momento, se seleccionaron y subcultivaron células monoclonales durante dos generaciones, y se recogió una cantidad suficiente de células para su verificación mediante transferencia Western y PCR.

Las secuencias de ARNip, ARNhc, ARNsg y control negativo se enumeran en las Tablas complementarias S1 y S2 del material complementario. El vector de shRNA se construyó utilizando el plásmido pLKO.1 y se empaquetó como lentivirus para infectar células y desactivar la expresión génica. El vector sgRNA para la activación de la transcripción MIAT se construyó utilizando el plásmido lentiSAM v2 (Puro), proporcionado por Adam Karpf (plásmido Addgene n.° 92062).

La proteína se transfirió a una membrana de PVDF (Millipore) y las membranas se incubaron con el anticuerpo primario y luego con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante contra IgG. Las membranas se expusieron con reactivo ECL (Thermo Fisher) y se analizaron mediante el sistema de imágenes de quimioluminiscencia Azure 300 (Azure Biosystems, EE. UU.). Los anticuerpos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria S3 y las imágenes originales de Western blot se proporcionan en Materiales complementarios.

El ARN total se extrajo usando TRIzol y se transcribió de manera inversa en ADNc usando el kit de reactivos PrimeScript RT con gDNA Eraser (TaKaRa, Cat#:RR047A). Posteriormente, se utilizó ADNc como plantilla para la amplificación por PCR en el instrumento ABI7500 utilizando ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Cat# Q331-03).

Las células sembradas en el portaobjetos o las secciones de tejido fresco congelado se fijaron posteriormente con paraformaldehído, se inactivaron con peróxido de hidrógeno, se repararon antigénicamente con tampón de ácido cítrico y se trataron con proteasa IV. La hibridación se realizó utilizando la sonda MIAT (ACD, Cat # 458501) y la muestra se marcó con tinte fluorescente TSA®Plus. Para el proceso de etiquetado dual de detección in situ de ARN y tinción inmunohistoquímica, la tinción de anticuerpos se realizó después de la hibridación de ARN. Los detalles se proporcionan en el manual del usuario de RNAscope® Multiplex Fluorescent V2 (Cat #323100, Advanced Cell Diagnostics, Inc.).

Se sembraron células cultivadas logarítmicamente en placas de 96 pocillos con 4000 células en cada pocillo y cinco réplicas en cada grupo. Después de que las células se adhirieron completamente a la pared (6 a 10 h), se midió el primer momento. Se añadieron a cada pocillo aproximadamente 10 µl de solución CCK-8 (Beyotime, Shanghai). Las células se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 h. La absorbancia a 450 nm se determinó utilizando un lector de microplacas.

Se usó el reactivo naranja CellROX (Yeasen) para marcar el peróxido de hidrógeno intracelular (H2O2) y se usó dihidroetidio (Beyotime) para marcar el anión superóxido intracelular (O2-). La sonda fluorescente se diluyó con medio libre de suero hasta una concentración final de 5 mM, se añadió a células cultivadas adherentes y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Las células se lavaron tres veces con PBS y luego se resuspendieron en PBS. La fluorescencia celular se detectó mediante citometría de flujo con una longitud de onda de excitación de 561 nm y una longitud de onda de emisión de 620 nm.

Las células LX-2 se privaron de alimento en medio sin suero durante 12 h y se estimularon con CIGB300 a diferentes concentraciones (2, 4, 6, 8 y 10 µM) o MK2206 (4 y 8 µM) durante 6 h. Se disolvió CIGB300 en PBS. MK2206 se disolvió en DMSO y se diluyó en PBS. Las células del grupo o grupos de control se trataron con PBS o DMSO diluido en PBS. Se recogieron las células, se añadieron anexina V-FITC y PI y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos. La apoptosis celular se detectó mediante citometría de flujo.

No se utilizaron métodos estadísticos para determinar el tamaño de la muestra de antemano. Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos experimentales. La inyección no fue a ciegas. No existen criterios de exclusión para los animales. Se utilizó Graphpad Prism 7.0 (GraphPad, San Diego, EE. UU.) para todos los análisis estadísticos. Los datos se expresaron como media ± SEM. La varianza fue similar entre los grupos que se estaban comparando estadísticamente. La importancia de las diferencias entre dos grupos se evaluó mediante la prueba t estándar cuando la varianza es similar entre los grupos. La significación se definió con un valor de P <0,05. Todos los experimentos se realizaron por triplicado al menos tres veces y se muestran datos representativos.

Nuestro estudio anterior demostró que la NPM aumentaba significativamente en los tejidos cirróticos de ratas, lo que sugiere que la NPM puede estar implicada en la fibrosis hepática [27]. En el presente estudio, se determinó la relevancia entre la NPM y la fibrosis hepática humana en microarrays de tejido de enfermedad hepática humana. La tinción IHC mostró que la NPM está regulada positivamente en los tejidos inflamatorios y cirróticos (Fig. 1A), y la fosforilación de la proteína NPM en Ser125 estuvo regulada positivamente significativamente en las células parenquimatosas del hígado o en las células no parenquimatosas (Fig. 1B) del tejido de cirrosis. , lo que sugiere que la NPM está relacionada con la progresión de la fibrosis hepática humana.

Los resultados de una tinción IHC indicaron un aumento significativo de la proteína NPM en el hígado inflamatorio y fibrótico y en el tejido canceroso de hígado de matrices de tejido del espectro de enfermedad hepática humana (LV20812a), que involucran 32 casos de tejido hepático normal, 48 casos de hepatitis, 72 casos de enfermedad hepática. cirrosis y 48 casos de tumor maligno. B Los resultados del análisis cuantitativo de la micromatriz de tejido hepático humano (LV805c) confirmaron que la fosforilación de NPM (Ser125) aumentó significativamente en las células parenquimatosas y no parenquimatosas del hígado en la etapa de cirrosis. El modelo de ratón CA de fibrosis hepática inducida por CCl4 confirmó que la NPM aumentaba notablemente durante la cirrosis. La tinción con hematoxilina-eosina (HE) y rojo de Sirio de los tejidos hepáticos sugirió cambios significativos en la fibrosis en los tejidos hepáticos inducidos por CCl4 (n = 5). La tinción inmunohistoquímica mostró que la NPM aumentó notablemente en los tejidos hepáticos de ratones tratados con CCl4. D Después de la inanición en medio libre de suero durante 24 h, se usó TGF-β1 para estimular las células LX-2 durante 48 h, y la transferencia Western mostró una mayor expresión de proteínas de NPM y α-SMA. E La PCR cuantitativa mostró que los ARNm de α-SMA y NPM aumentaron después del tratamiento con TGF-β1. F Las HSC de ratón primarias aisladas se activaron y la expresión de NPM aumentó durante el cultivo. Los datos mostrados representan el resultado de tres experimentos independientes. Los datos de expresión de WB o qPCR se cuantificaron relativamente de acuerdo con los niveles de expresión del gen de β-actina o α-tubulina. Media ± EEM; *p < 0,1, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001; t prueba.

En ratones con fibrosis hepática inducida por CCl4, la tinción con HE y rojo Sirius mostró cambios significativos en la fibrosis en el hígado (Fig. 1C). En el caso de la fibrosis, los resultados de la IHC mostraron que la NPM en los tejidos del hígado aumentaba notablemente. Por lo tanto, la NPM y la fibrosis hepática de ratón están correlacionadas, y la NPM puede estar implicada en la progresión de la fibrosis hepática.

Dado que las HSC son las principales células efectoras de la fibrosis hepática, y su activación y secreción de colágeno son los eventos centrales de la fibrosis hepática, primero nos centramos en las HSC y analizamos la relevancia entre la expresión de NPM y la activación de las HSC. La activación de HSC LX-2 inducida por TGF-β1 es un modelo de células de fibrosis hepática ampliamente utilizado. El análisis de transferencia Western y PCR cuantitativa mostró que ambos marcadores de fibrosis α-SMA y NPM aumentaron de manera dependiente de la dosis después del tratamiento con TGF-β1 (Fig. 1D, E). Teniendo en cuenta que LX-2 es una HSC activada, examinamos los cambios de NPM en las HSC primarias aisladas de ratón durante la activación. Los resultados de WB mostraron que las HSC primarias se activaron gradualmente durante el cultivo y la NPM aumentó significativamente con el aumento de α-SMA y colágeno I (Fig. 1F).

Para determinar el papel de NPM en la activación de HSC, se utilizaron técnicas CRISPR-Cas9 y pequeños ARN de interferencia (siRNA) para silenciar la expresión de NPM en HSC humanas (LX-2) y de rata (CSFC-2G), respectivamente. Cuando el NPM en las células CSFC-2G y LX-2 se eliminó por completo, la expresión de los marcadores de fibrosis α-SMA, colágeno I y MMP9 se reguló notablemente a la baja (Fig. 2A, B). La eliminación de NPM por parte de los ARNip también disminuyó los marcadores de fibrosis en diversos grados (Fig. 2C, D). La proteína NPM fue derribada o sobreexpresada aún más en HSC primarias de ratón cultivadas durante 13 días. Con el cambio de NPM, los marcadores de fibrosis hepática también disminuyeron o aumentaron en consecuencia, lo que sugiere que la NPM afecta el nivel de los marcadores de fibrosis hepática (Fig. 2E). Los resultados de la transferencia Western muestran que una molécula pequeña CIGB300, que podría unirse a la proteína NPM e inhibir la fosforilación en Ser125 [25, 28], inhibía de forma dependiente de la dosis α-SMA, colágeno I y MMP9 en células LX-2 (Fig. 2F). . El α-SMA es un marcador para la transdiferenciación de HSC en miofibroblastos. Por lo tanto, la NPM puede afectar significativamente la transdiferenciación de las HSC y la síntesis de colágeno.

Los resultados de una transferencia Western mostraron que cuando CRISPR-Cas9 derribó la NPM en las células CSFC-2G y LX-2, los niveles de expresión de α-SMA, colágeno I y MMP9 se redujeron drásticamente. B La PCR cuantitativa confirmó la disminución de la expresión de ARNm de α-SMA, colágeno I y MMP9 en células LX-2 y CSFG-2G con NPM desactivado. Los resultados del análisis de transferencia C Western mostraron que la eliminación de NPM por parte de los ARNip disminuyó los marcadores de fibrosis, incluidos α-SMA, colágeno I y MMP9 en células LX-2. D La PCR cuantitativa confirmó aún más la eliminación de NPM por parte de los ARNip y la reducción de α-SMA, colágeno I y MMP9. La proteína E NPM fue eliminada o sobreexpresada en células estrelladas hepáticas primarias cultivadas durante 13 días, y los marcadores de fibrosis hepática disminuyeron o aumentaron en consecuencia. F CIGB300, una molécula pequeña inhibidora de la fosforilación Ser125 de la proteína NPM, α-SMA, colágeno I y MMP9 regulados negativamente en células LX-2. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes y de la cuantificación relativa de los datos basados ​​en la expresión del gen β-actina o α-tubulina. norte ≥ 3; media ± EEM; **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001; Prueba T.

La proliferación y la migración son características importantes de la activación de HSC. En consecuencia, examinamos el efecto de la NPM en la proliferación y migración de HSC. Los resultados del ensayo de proliferación CCK-8 mostraron que la eliminación de NPM en células CSFC-2G (Figura 1A complementaria) o la eliminación de NPM en células LX-2 humanas (Figura 1B) inhibieron significativamente la proliferación celular. Los ensayos de Transwell y Scratch mostraron que el silenciamiento de NPM inhibió significativamente la migración de células CSFC-2G (SFig. 1C) y LX-2 (SFig. 1D).

Los liposomas recubiertos de retinol pueden dirigirse eficazmente a las HSC para la administración de ARNip debido a su notable capacidad de absorción de vitamina A. Los porcentajes de enriquecimiento de ARNip transportados por liposomas recubiertos de retinol (VA-Lip-siRNA) en HSC primarias, macrófagos y hepatocitos fueron del 32,96%, 1,65% y 0,21%, respectivamente, lo que muestra una fuerte especificidad para las HSC [26]. Para demostrar que la NPM en las HSC afecta la fibrosis, se inyectó el complejo VA-Lip-siNPM en la vena de la cola de ratones con fibrosis hepática inducida por CCl4 para eliminar la NPM en las HSC (Fig. 3A). Se utilizó una mezcla igual de dos ARNip dirigidos a NPM para reducir posibles efectos fuera del objetivo. El efecto de enriquecimiento de VA-Lip-siRNA en HSC se evaluó utilizando siRNA marcado con FAM como molécula trazadora. La observación por microscopía confocal mostró que el ARNip marcado con FAM estaba enriquecido principalmente en la región del portal y tenía una co-localización significativa con α-SMA, lo que sugiere el efecto de direccionamiento específico de los VA-Lip-siRNA en las HSC (Fig. 3A). El análisis de fluorescencia mostró que la proteína NPM en las HSC estaba significativamente disminuida por siNPM (Fig. 3B). El análisis de transferencia Western del tejido hepático de ratón mostró que la expresión de α-SMA, colágeno tipo I y Akt fosforilada también se reguló negativamente con la eliminación de NPM (Fig. 3C). La tinción con IHC y la tinción con rojo Sirio del tejido hepático de ratón también confirmaron la regulación negativa de α-SMA y el colágeno tipo I (Fig. 3D). La expresión de NPM se correlacionó positivamente con α-SMA y colágeno (Fig. 3E). Por lo tanto, la eliminación de NPM en HSC inhibió significativamente la fibrosis hepática inducida por CCl4 en ratones.

Una expresión de NPM de HSC activadas en hígado de ratón fue eliminada por un complejo VA-lip-ARNip específico de HSC de ratón mediante inyección en la vena de la cola. Imágenes fluorescentes representativas de α-SMA (rojo) y VA-lip-siRNA-FAM (verde) en muestras de hígado de ratones cirróticos tratados con tetracloruro de carbono indicaron que VA-lip-siRNA-FAM estaba específicamente enriquecido en HSC. A los ratones (n = 5/grupo) se les inyectó VA-lip-siNPM o VA-lip-siNC cada 3 días (10 inyecciones en total). Las muestras de hígado se recolectaron 24 h después de la última inyección de VA-lip-siRNA-FAM. B La fluorescencia de colocación amarilla de NPM y α-SMA mostró que siNPM reguló significativamente a la baja la expresión de NPM en HSC. El análisis de transferencia C Western de tejidos hepáticos confirmó que la NPM aumentó significativamente en el hígado. Los niveles de expresión de α-SMA, colágeno I y Akt fosforilado disminuyeron significativamente. La tinción D IHC y la tinción con rojo Sirius confirmaron que el nivel de NPM disminuyó significativamente con VA-lip-siNPM, y las expresiones de marcadores de fibrosis hepática, como α-SMA y colágeno (tinción con rojo Sirius), se redujeron significativamente. La prueba de correlación de E Pearson mostró que la NPM se correlacionaba positivamente con α-SMA y colágeno I. Media ± SEM; **p < 0,01; Prueba T.

La NPM es una proteína multifuncional, entonces, ¿puede inhibir directamente la función de la proteína NPM atenuar la fibrosis? Para responder a esta pregunta, se disolvió CIGB300, un inhibidor funcional de la proteína NPM con una estructura peptídica transmembrana, en PBS y se administró a través de la vena de la cola a ratones con fibrosis hepática inducida por CCl4.

Se utilizaron tinciones con HE y rojo Sirius para observar los cambios patológicos y la deposición de colágeno del tejido hepático, respectivamente. CCl4 causa daño hepático mediante la destrucción o desaparición de los lóbulos hepáticos normales, que son reemplazados por lóbulos falsos, edema de células hepáticas, esteatosis y disposición de regeneración nodular. CIGB300 alivia significativamente estos cambios histológicos (Fig. 4A). La tinción con rojo Sirio mostró que CIGB300 redujo significativamente la deposición anormal de colágeno y la fibrosis causada por CCl4 (Fig. 4B). El análisis IHC mostró que la fosforilación de NPM (Ser125), que estaba significativamente regulada positivamente en los tejidos de fibrosis hepática, fue regulada negativamente por CIGB300 (Fig. 4D, E). La inmunofluorescencia (Fig. 4C) y el análisis IHC (Fig. 4D, E) confirmaron que NPM, α-SMA y colágeno I, que también están regulados positivamente por CCl4, fueron regulados negativamente por CIGB300. El análisis de correlación mostró que NPM era se correlacionó positivamente con α-SMA y colágeno I, y la fosforilación de NPM (Ser125) se correlacionó positivamente con estos marcadores de fibrosis hepática (Fig. 4F). Curiosamente, CIGB300 no solo inhibió la fosforilación de Ser125, sino que también redujo la NPM en los tejidos (Fig. 4D), lo que sugiere que la expresión y la fosforilación de NPM pueden regularse de forma compleja en el tejido hepático. Las moléculas posteriores reguladas por NPM pueden interactuar con diferentes células en los tejidos hepáticos de manera de retroalimentación positiva, lo que resulta en un cambio en la expresión de NPM. Es importante señalar que los objetivos de CIGB300 no son específicos de cada célula, lo que significa que la función implicada en NPM Ser125 puede inhibirse en todos los tipos de células del tejido hepático.

Se indujo fibrosis hepática mediante inyección intraperitoneal de CCl4 en ratones C57BL/6, y se disolvió CIGB300 en PBS y se administró a través de la vena de la cola para inhibir la función de la proteína NPM. Se colocaron cinco ratones en cada grupo. Unas imágenes representativas de la tinción con HE mostraron la patología del tejido hepático en modelos murinos de fibrosis hepática inducida por CCL4. CIGB300 protegió significativamente el tejido hepático del daño causado por CCl4 a las células y estructuras tisulares del hígado. La barra de escala corresponde a 100 μm. La tinción con rojo B Sirius mostró una deposición significativa de colágeno en los tejidos hepáticos de ratones inducida por CCl4, que disminuyó significativamente después del tratamiento con CIGB300 (n = 5/grupo). La barra de escala corresponde a 250 μm. C La inmunofluorescencia de secciones de parafina mostró que tanto los niveles de expresión de NPM como de α-SMA aumentaron en los tejidos hepáticos de ratones inducidos por CCl4. El tratamiento con CIGB300 redujo significativamente ambos. El nivel de expresión de NPM y α-SMA se correlacionó positivamente. NPM se marcó con fluorescencia verde y α-SMA se marcó con fluorescencia roja. Imágenes representativas. La barra de escala corresponde a 50 μm. D, E La detección por IHC mostró que CIGB300 inhibió significativamente la regulación positiva inducida por CCl4 de la proteína NPM, la fosforilación de NPM S125, α-SMA y la proteína colágeno I en tejido hepático con fibrosis de ratón. F El análisis de datos cuantitativos mostró una correlación positiva entre la proteína NPM o la fosforilación de NPM S125 y los marcadores de fibrosis hepática en los tejidos hepáticos. Los datos mostrados son representantes de tres experimentos independientes. norte ≥ 3; media ± EEM; *p<0,05, ***p<0,001; Prueba T.

Por lo tanto, la NPM en el tejido hepático de ratón se correlacionó positivamente con la α-SMA en las HSC, y la inhibición de la función de la proteína NPM de las células del tejido hepático puede reducir las HSC activadas y la secreción de colágeno, inhibiendo así la fibrosis hepática.

Los estudios in vitro e in vivo mencionados anteriormente confirmaron el papel de la NPM en la promoción de la fibrosis hepática. El mecanismo por el cual la NPM promueve la fibrosis hepática se investigó en HSC. El Akt nuclear activo interactúa con el NPM para prevenir la escisión proteolítica del NPM [29], pero aún no está claro si el NPM afecta la actividad de Akt. El ensayo de transferencia Western confirmó que la fosforilación de Akt en HSC estaba regulada positivamente por el factor fibrogénico TGF-β1 (Fig. 5A), pero fue inhibida significativamente por el silenciamiento con NPM (Fig. 5B) o el tratamiento con CIGB300 (Fig. 5C). Por lo tanto, la NPM puede promover la fibrosis hepática al activar la vía Akt. Para probar esta hipótesis, se utilizó MK2206, un inhibidor de Akt, para tratar las HSC. Los resultados muestran que los marcadores de fibrosis hepática α-SMA y colágeno I se regularon negativamente cuando se inhibió la fosforilación de Akt en diferentes concentraciones de MK2206 (Fig. 5D). Mientras que el activador de Akt SC79 reguló positivamente α-SMA y colágeno I en células LX-2 (Fig. 5E). Se confirmaron resultados similares en las células estrelladas hepáticas primarias (Fig. 5F). Por tanto, la NPM promueve la fibrosis hepática activando la señalización de Akt.

Un factor fibrogénico TGF-β1 aumentó la fosforilación de Akt en células LX-2. La eliminación o eliminación de B NPM inhibió la fosforilación de AKT en células estrelladas hepáticas LX-2. La eficiencia de eliminación de NPM en LX-2 se verificó y se muestra en la Fig. 2A. C El inhibidor de NPM CIGB300 inhibió la fosforilación de AKT en HSC LX-2. El inhibidor de la fosforilación de D Akt MK2206 redujo la expresión de proteínas de colágeno I, MMP9 y α-SMA en células LX-2. El activador SC79 de E Akt reguló positivamente la expresión de marcadores de fibrosis hepática. F El colágeno I y α-SMA disminuyeron o aumentaron mediante el inhibidor o activador de Akt correspondientemente en las células estrelladas hepáticas primarias. Los datos mostrados son representantes de tres experimentos independientes. norte ≥ 3; media ± EEM; *p<0,05, ***p<0,001; Prueba T.

La activación de las HSC es el evento central en el proceso de la fibrosis hepática, y las ROS son un medio efector importante en la etapa inicial de la fibrosis hepática, que puede activar las HSC inactivas [30]. Sin embargo, diferentes niveles de ROS tienen diferentes efectos sobre las células [31]. La ROS moderada inactiva PTEN, promueve la vía de señalización PI3K/Akt y, en última instancia, conduce a la progresión del tumor [32]. El exceso de ROS puede dañar la estructura celular de las células cancerosas proliferativas, especialmente el exceso de ROS induce mutaciones en el ADN y altera la integridad genómica, lo que lleva a la senescencia y muerte celular [33]. Nuestros estudios previos confirmaron que la NPM regula negativamente las ROS mediante la proteína antioxidante PRDX6 en las células tumorales [34, 35]. Por lo tanto, la NPM puede tener un efecto protector sobre las HSC proliferativas activadas al regular negativamente las ROS.

Para confirmar la hipótesis anterior, examinamos los efectos de NPM sobre ROS y apoptosis en células LX-2 humanas y HSC primarias de ratón. Los resultados de la citometría de flujo mostraron que después de la eliminación de NPM en células LX-2 humanas y HSC primarias de ratón, el peróxido de hidrógeno intracelular y el anión superóxido aumentaron significativamente y se indujo la apoptosis (Fig. 6A, B, SFig. 4A). Para verificar in vivo que NPM podría disminuir ROS y reducir la apoptosis de HSC, repetimos el experimento del modelo de fibrosis hepática en ratón en la Fig. 3, usando VA-lip-siNPM para reducir la expresión de NPM de mHSC en tejido hepático y NAC para inhibir ROS. Desarrollamos un método de separación y etiquetado rápido y simultáneo (aproximadamente 110 minutos en total) para etiquetar el estado de ROS y el nivel de apoptosis de las HSC primarias durante el aislamiento para la posterior detección por citometría de flujo. Se realizaron experimentos de WB con las células estrelladas hepáticas primarias restantes después de la prueba de flujo, y se confirmó que la expresión de NPM fue efectivamente eliminada por VA-lip-siNPM. Los resultados de la citometría de flujo confirmaron que NPM Knockdown en HSC reguló positivamente ROS e indujo más apoptosis en modelos de fibrosis hepática de ratón, mientras que la inhibición de ROS por NAC redujo la apoptosis inducida por siNPM (SFig. 4B, Fig. 6C). El inhibidor de NPM CIGB300 también aumentó los niveles de ROS y aumentó significativamente la apoptosis en las células LX-2 (Fig. 6D). El inhibidor de ROS, la N-acetil-L-cisteína (NAC), disminuyó las ROS inducidas por CIGB300 y redujo la apoptosis inducida por CIGB300 en células LX-2 y mHSC primarias (Fig. 6D, E, SFig. 5). Por lo tanto, NPM inhibe la apoptosis al regular negativamente el nivel de ROS, mientras que CIGB300 promueve la apoptosis de las HSC al regular positivamente ROS.

Se utilizaron reactivo CellROX Orange y dihidroetidio para marcar el peróxido de hidrógeno intracelular y el anión superóxido. El nivel de ROS y la apoptosis de las HSC se detectaron mediante citometría de flujo. Los resultados de una citometría de flujo mostraron que la eliminación de NPM redujo notablemente el peróxido de hidrógeno y el anión superóxido en células LX-2 humanas y HSC primarias de ratón. B La citometría de flujo mostró que la eliminación de NPM indujo significativamente la apoptosis de LX-2 y HSC primarias de ratón. C El análisis de citometría de flujo de HSCS primario aislado de tejido hepático de ratones fibróticos mostró que cuando VA-lip-siNPM reguló específicamente a la baja la expresión de NPM de HSC en el tejido hepático, ROS aumentó y aumentó la apoptosis. Cuando la NAC reguló negativamente las ROS reguladas al alza en el tejido hepático, la apoptosis de HSC se redujo (n = 3). Los resultados de la citometría de flujo D mostraron que el inhibidor de ROS NAC inhibió de manera dependiente de la dosis el peróxido de hidrógeno y la apoptosis inducidos por CIGB en células LX-2. E NAC inhibió el peróxido de hidrógeno y la apoptosis inducidos por CIGB en HSC primarias de ratón. Los resultados de la citometría de flujo F mostraron que la NAC redujo el peróxido de hidrógeno inducido por MK2206 y redujo la apoptosis en las células LX-2. G NAC redujo el peróxido de hidrógeno inducido por MK2206 y redujo la apoptosis en HSC primarias de ratón. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes y los datos de cuantificación se presentaron como media ± SEM; Intensidad de fluorescencia media de MFI, células WT no tratadas, control negativo NC, ns diferencia no significativa, **p < 0,01, ***p < 0,001; Prueba T.

La regresión de la fibrosis se asocia con la inactivación o apoptosis de las HSC y miofibroblastos, lo que hace que la muerte de las HSC sea un mecanismo importante para la resolución de la fibrosis hepática [36]. La eliminación y la inhibición de NPM inactivan la señalización de Akt y aumentan las ROS y la apoptosis. Analizamos más a fondo los efectos de Akt sobre ROS y la apoptosis en HSC. Los resultados de la citometría de flujo mostraron que el inhibidor de Akt MK2206 aumentó significativamente el nivel de ROS e indujo la apoptosis, mientras que el inhibidor de ROS NAC redujo las ROS inducidas por MK2276 y redujo significativamente la apoptosis en células LX-2 (Fig. 6F) y mHSC primarias (Fig. 6G). confirmando la existencia del eje de apoptosis inducido por AKT / ROS en HSC.

Resumiendo los resultados anteriores, se puede concluir que la NPM promueve la fibrosis hepática al inhibir la apoptosis de las HSC a través de la vía Akt/ROS/Apoptosis.

Además de la vía Akt/ROS/Apoptosis, intentamos encontrar otras vías involucradas en los efectos fibróticos de la NPM. En los datos del transcriptoma analizados con el software DESeq2, encontramos que la molécula de ARN larga no codificante MIAT fue el único gen regulado negativamente con diferencias significativas después del tratamiento con el inhibidor de Akt MK2206 (SFig. 6A), y se ha demostrado que MIAT está involucrado en la desarrollo de fibrosis renal [37]. Nos preguntamos si MIAT estaba implicado en la regulación de la fibrosis hepática. Por lo tanto, detectamos la expresión de MIAT y su efecto profibrosis en modelos de células de fibrosis hepática.

MIAT aumentó significativamente en las células LX-2 tratadas con TGF-β1 (Fig. 7A). Investigamos más a fondo la relación regulatoria entre NPM, Akt y MIAT, y descubrimos que la eliminación de NPM por siRNA disminuyó significativamente la expresión de MIAT en células LX-2 y células estrelladas hepáticas primarias de ratón, mientras que el inhibidor de Akt MK2206 o el activador SC79 regulaban hacia abajo o hacia arriba. expresión MIAT regulada (Fig. 7B), respectivamente. Combinados con el papel previamente confirmado de NPM en la regulación de Akt, estos resultados confirman que NPM regula la expresión de MIAT a través de la señalización de Akt.

Una PCR cuantitativa mostró que la expresión de MIAT estaba regulada positivamente en células LX-2 tratadas con TGFβ1. B La PCR cuantitativa mostró que la expresión de NPM fue eliminada por un pequeño ARN de interferencia, y el nivel de MIAT se redujo significativamente en las células LX-2 y LO2. C La PCR cuantitativa mostró que la sobreexpresión endógena de MIAT reguló positivamente los niveles de expresión de α-SMA, colágeno y MMP9. La expresión endógena de MIAT fue regulada positivamente por el sistema de activación del gen CRISPR/dCAS9. El sgMIAT es un pequeño ARN guía dirigido a la región promotora de MIAT. El dCas9 inactivado se une al promotor, y el elemento activador transcripcional fusionado en dCas9 reguló notablemente la expresión endógena de MIAT. Los resultados de la transferencia Western D confirmaron la expresión regulada positivamente de α-SMA, colágeno I y MMP9 y mostraron que MIAT aumentó el nivel de ciclina D1. El ensayo de proliferación E CCK8 mostró que la capacidad de proliferación de las células LX-2 estaba regulada hacia arriba o hacia abajo después de la sobreexpresión de MIAT o la eliminación de shRNA/siRNA. La PCR cuantitativa F mostró que los niveles de expresión de colágeno I y MMP9 disminuyeron notablemente después de la eliminación del ARNip de la expresión de MIAT. G El análisis cuantitativo por PCR mostró que la sobreexpresión endógena de MIAT regulaba positivamente el ARNm de TGF-β2 y la eliminación de MIAT disminuía el ARNm de TGF-β2. Los resultados del análisis de transferencia Western H confirmaron que la expresión de MIAT activada regulaba positivamente TGF-β2 y α-SMA en células LX-2. Los resultados del análisis de transferencia Western mostraron que el tratamiento con TGF-β2 aumentó la expresión de colágeno I y α-SMA en células LX-2. J El análisis cuantitativo por PCR mostró MIAT regulado positivamente por TGF-β2 en células LX-2. K La transfección de células LX-2 con imitadores de miR-16-5p redujo la expresión de TGF-β2. L La activación de la expresión de MIAT endógena en células LX-2 redujo la expresión de miR-16-5p, mientras que la transfección de miR-16-5p imita las células LX-2 y la MIAT activada disminuyó la MIAT endógena. M miR-16-5p puede unirse a secuencias de moléculas de ARN MIAT y TGF-Β2. Las secuencias entre las bases 2601–2909 en MIAT y 5791–5962 en el ARNm de TGF-β2 se insertaron en los sitios aguas abajo de la región codificante de luciferasa del plásmido PGL3. El ensayo indicador de luciferasa dual N mostró que los imitadores de miR-16-5p redujeron la expresión de luciferasa, pero los imitadores no tuvieron ningún efecto de unión en los sitios de unión mutados en MIAT o TGF-β2. El análisis qPCR de HSC primarias aisladas de tejidos hepáticos de ratones fibróticos mostró que el inhibidor de Akt MK2206 inhibía la expresión de MIAT y TGF-β2 in vivo, mientras que los imitadores de miR-16-5p también regulaban negativamente la expresión de MIAT y TGF-β2 en mHSC in vivo. Los datos mostrados son representantes de tres experimentos independientes. norte ≥ 3; media ± EEM; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Prueba T.

A continuación, estudiamos más a fondo el efecto de MIAT sobre los marcadores de fibrosis hepática. Se utilizó el sistema CRISPR-dCas9 para activar la expresión de MIAT endógeno (Fig. 7C), y el MIAT regulado al alza aumentó significativamente los marcadores de fibrosis hepática α-SMA, colágeno I y MMP9 de LX-2 (Fig. 7C). D) y promovió la proliferación celular (Fig. 7E). La eliminación de MIAT disminuyó la proliferación (Fig. 7E) y reguló negativamente los marcadores de fibrosis hepática (Fig. 7F). Por lo tanto, hemos identificado otra posible vía reguladora para que NPM promueva la fibrosis a través de Akt/MIAT.

Para determinar los genes relacionados con la fibrosis regulados por MIAT, se realizó un análisis de secuencia de ARN en las células LX-2 con MIAT regulado hacia abajo o hacia arriba. Entre los genes expresados ​​de manera más diferencial, MIAT aumentó la regulación del TGF-β2 (SFig. 6B). El efecto de regulación positiva de MIAT sobre TGF-β2 se confirmó mediante PCR cuantitativa y transferencia Western en células LX-2 con expresión de MIAT activada (Fig. 7G, H). La eliminación de MIAT redujo el ARNm de TGF-β2 en HSC LX-2 (Fig. 7G). Pruebas adicionales mostraron que α-SMA y colágeno I estaban regulados significativamente por TGF-β2 en LX-2 (Fig. 7I). Por tanto, MIAT puede regular la secreción de TGF-β2 y promover la expresión de marcadores de fibrosis hepática. Curiosamente, TGF-β2 también reguló positivamente el nivel de MIAT de las HSC, creando una retroalimentación positiva (Fig. 7J).

Para dilucidar el mecanismo molecular por el cual MIAT regula los niveles de TGF-β2, el análisis de secuencia utilizando la herramienta DIANA reveló que miR-16-5p tenía múltiples sitios de unión en el ARN de MIAT y el ARNm de TGF-β2 (SFig. 7), lo que sugiere que miR -16-5p podría regular los niveles intracelulares de MIAT y NPM como un ARN endógeno competitivo. Para probar esta hipótesis, transfectamos imitadores de miR-16-5p en células LX-2, y el MIAT intracelular y el ARNm de TGF-β2 se redujeron significativamente (Fig. 7K, L). Los imitadores de miR-16-5p también regularon negativamente el colágeno tipo I y III y la capacidad de proliferación celular de LX-2 (SFig. 8). Se clonaron cuatro fragmentos de nucleótidos alrededor de los sitios de unión de miR-16-5p en la molécula MIAT y se insertaron en la UTR 3' de la luciferasa del plásmido pGL3. El fragmento mutado se construyó como control (Fig. 7M, SFig. 9). El ensayo de indicador de luciferasa doble reveló que los imitadores de miR-16-5p podrían unirse a uno de los fragmentos MIAT (2601-2909) y reducir significativamente la expresión de luciferasa, pero no al fragmento mutado (Fig. 7N). Por tanto, miR-16-5p puede unirse a MIAT para regular su estabilidad. Además, insertamos el fragmento de unión miR-16-5p del ARNm de TGF-β2 en la UTR 3 'de luciferasa para construir pGL3-TGF-β2 y controlar el plásmido con el sitio mutado. El ensayo informador de luciferasa dual confirmó que miR-16-5p podría unirse al ARNm de TGF-β2 y regular su nivel (Fig. 7N).

Para validar la vía Akt-MIAT-miR-16-TGF-β2 in vivo, tratamos ratones C57 con fibrosis hepática con un inhibidor de AKT, MK2206, para analizar el efecto de Akt en la expresión de los genes MIAT y TGF-β2 en sentido descendente en HSC. Además, utilizamos imitadores de miR-16-5p para tratar ratones con fibrosis hepática y analizamos los efectos de miR-16-5p en MIAT y TGF-β2. Después de 36 h de tratamiento, se sacrificaron los ratones del grupo de control y de cada grupo de tratamiento, y se aislaron las HSC de los tejidos del hígado. Los cambios de expresión de MIAT y TGF-β2 se detectaron en las HSC primarias aisladas de cada grupo, para verificar la influencia de la señal de AKT en MIAT y TGF-β2, así como el efecto de promoción de MIAT sobre TGF-β2 a través de la adsorción. de miR-16-5p. Los resultados de qPCR mostraron que la inhibición de la señal de Akt regulaba negativamente el ARN MIAT y el ARNm de TGF-β2, y los imitadores de miR-16-5p pueden regular simultáneamente MIAT y TGF-β2 in vivo (Fig. 7O). Estos resultados sugieren que Akt promueve la expresión de MIAT, y el MIAT regulado positivamente a su vez regula positivamente el ARNm de TGF-β2 al esponjar competitivamente miR-16-5p, promoviendo así la expresión de marcadores de fibrosis hepática de HSC de manera autocrina.

Nuestros resultados confirmaron la existencia de una vía reguladora NPM/MIAT/miR-16-5p/TGF-β2 en HSC humanas. La tinción IHC de matrices de tejido con enfermedad hepática humana mostró que el TGF-β2 estaba regulado positivamente en los tejidos fibróticos (Fig. 8A). La tinción con IHC indicó que la proteína TGF-β2 estaba significativamente regulada negativamente en los tejidos fibróticos de ratones tratados con siNPM, y la expresión de TGF-β2 estaba fuertemente correlacionada con la de NPM (P = 0,003, R = 0,8572). El TGF-β2 se expresó principalmente en las células del tracto porta y en los hepatocitos lesionados, y estos últimos mostraron la picnosis nuclear característica de las células necróticas (Fig. 8B, SFig. 2). Un análisis adicional de colocación mediante inmunofluorescencia reveló que el TGF-β2 se expresaba principalmente en hepatocitos necróticos y células de Kupffer en lugar de HSC en tejidos fibróticos del hígado (Fig. 8B).

Un análisis de matrices de tejido de enfermedades hepáticas humanas (LV20812a, ensayo) mostró que el TGF-β2 está regulado positivamente en los tejidos fibróticos. La tinción B IHC y el análisis de inmunofluorescencia mostraron que el TGF-β2 se distribuye principalmente en células hepáticas y macrófagos. La transferencia C Western confirmó que los hepatocitos necróticos inducidos por CCl4 expresaban más proteínas NPM y TGF-β2. Las células se trataron con 10 mmol/ml de CCl4 disuelto en DMSO durante 6 h y las células se recogieron para la extracción de proteínas después de 24 h. El análisis de transferencia Western D confirmó que la eliminación de NPM en células LO2 reguló significativamente a la baja la expresión de TGF-β2, y la expresión de colágeno I y α-SMA en las células LX-2 cocultivadas con LO2 disminuyó. Los resultados del análisis de transferencia Western E confirmaron que la expresión de marcadores de fibrosis hepática en células LX-2 se reguló negativamente cuando el TGF-β2 secretado por células LO2 en medio de cultivo se eliminó con anticuerpo. F En el modelo de ratones, se inyectó TGF-β2 en ratones con fibrosis hepática inducida por CCl4 por la vena de la cola durante la recuperación. La tinción con rojo Sirio y el análisis IHC mostraron que el tratamiento con TGF-β2 reguló positivamente la expresión de marcadores de fibrosis hepática y NPM. El análisis de correlación G confirmó que TGF-β2 estaba fuertemente correlacionado con NPM y la deposición de colágeno. H Modelo de trabajo de NPM en la promoción de la fibrosis hepática. Los datos mostrados son representantes de tres experimentos independientes. Media ± EEM; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Prueba T.

Teniendo en cuenta que los hepatocitos representan la mayor proporción de células en el tejido hepático, los hepatocitos necróticos pueden expresar mucha más proteína TGF-β2 que los de las HSC o los macrófagos hepáticos. Para confirmar la regulación positiva de la proteína TGF-β2 en hepatocitos apoptóticos necróticos, indujimos la necrosis de la línea celular de hepatocitos humanos cultivados LO2 utilizando CCl4. El ensayo de transferencia Western confirmó que la proteína NPM y TGF-β2 aumentaron después de 6 h de tratamiento con CCl4 (Fig. 8C).

Es necesario determinar si la NPM en los hepatocitos promueve la secreción de TGF-β2 a través de paracrinos, afectando así la activación de las HSC y la expresión de los marcadores de fibrosis. En consecuencia, eliminamos o sobreexpresamos NPM en los hepatocitos LO2, y el análisis de transferencia Western confirmó que la expresión de TGF-β2 cambió notablemente. Además, los marcadores de fibrosis hepática en células LX-2 cocultivadas con células LO2 en cámaras Transwell estaban regulados hacia abajo o hacia arriba (Fig. 8D). Para confirmar aún más el papel de TGF-β2 en el sistema de cocultivo, eliminamos la proteína TGF-β2 del medio de cultivo mediante inmunoprecipitación utilizando el anticuerpo TGF-β2, y WB mostró una expresión significativamente reducida de α-SMA y colágeno I en LX. -2 células cultivadas en este medio condicionado (Fig. 8E). Por lo tanto, la NPM puede activar la secreción de TGF-β2 en los hepatocitos, promoviendo así la activación de HSC y la síntesis de colágeno.

TGF-β2 se expresó fuertemente en macrófagos en la región de la vena porta, y la intensidad de la expresión fue mucho mayor que en los hepatocitos o HSC (Fig. 8B, SFig. 3). Para confirmar el efecto de NPM en la expresión de TGF-β2 en macrófagos, eliminamos o sobreexpresamos la proteína NPM en macrófagos derivados de monocitos humanos THP-1 y macrófagos de ratón RAW264.7. Los resultados de WB confirmaron que la proteína TGF-β2 estaba regulada por cambios en la expresión de NPM. Además, la expresión de α-SMA y colágeno I cambió en HSC humanas (LX-2) o HSC de ratón (SFig. 10A, B) cocultivadas con macrófagos. Para confirmar que los cambios de α-SMA y colágeno I son causados ​​por la proteína TGF-β2, eliminamos aún más la proteína TGF-β2 del sobrenadante del medio de cultivo de macrófagos mediante inmunoprecipitación. La expresión de α-SMA y colágeno I en LX-2 o HSC de ratón cambió significativamente después de 36 h de cultivo en este medio condicionado (SFig. 10C), lo que indica que el TGF-β2 secretado por los macrófagos afectó notablemente la activación y expresión de colágeno de HSC en el sistema de cocultivo.

El TGF-β2 participa en la fibrosis de las enfermedades hepáticas de origen biliar [16]. El efecto de TGF-β2 sobre la fibrosis hepática inducida por CCl4 en ratones Balb/c se determinó mediante inyección en la vena de la cola de TGF-β2 activo durante 4 semanas después de la inducción de CCl4 (Fig. 8F). La tinción IHC (Fig. 8F) y el análisis de transferencia Western (SFig. 11A) mostraron que TGF-β2 aumentó la expresión de colágeno I, NPM y AKT fosforilada. La fibrosis hepática inducida por CCl4 en ratones C57Bl6J mostró resultados similares (SFig. 11B). El análisis de correlación confirmó que TGF-β2 estaba fuertemente correlacionado con NPM y la deposición de colágeno (Fig. 8G). Por lo tanto, en combinación con resultados previos de hepatocitos y macrófagos, nuestros hallazgos confirmaron que la NPM promovió la secreción de TGF-β2 en hepatocitos y macrófagos, activó las HSC de manera paracrina y promovió la fibrosis hepática.

En resumen, propusimos un modelo de trabajo para demostrar el mecanismo por el cual la NPM promueve la fibrosis hepática (Fig. 8H); La NPM, que se expresa ampliamente en el tejido hepático, se regula positivamente durante la fibrosis hepática por varios factores. La regulación positiva de NPM en HSC inhibe aún más los niveles de ROS y la apoptosis inducida por ROS activando Akt y regulando la expresión de PRDX6, promoviendo así la activación de HSC y la secreción de colágeno. CIGB300, un inhibidor de la fosforilación de NPM en Ser125, inhibe Akt y regula positivamente la apoptosis de las HSC, inhibiendo así la progresión de la fibrosis hepática. Además, NPM regula positivamente la molécula de ARN no codificante MIAT por Akt, promoviendo así la expresión y secreción de TGF-β2 al esponjar competitivamente miR-16-5p. El TGF-β2, que se deriva de hepatocitos lesionados, células de Kupffer y HSC, activa la proliferación y secreción de colágeno de las HSC de modo paracrino o autocrino y promueve el proceso de fibrosis hepática. Teniendo en cuenta la gran cantidad de hepatocitos, los hepatocitos lesionados pueden ser la principal fuente de TGF-β2 en la etapa inicial de la fibrosis hepática en ratones.

No se ha informado la relevancia entre la NPM y la fibrosis hepática. En el presente estudio, demostramos que el silenciamiento de NPM o el inhibidor de NPM CIGB300 alivió significativamente la fibrosis hepática tanto en modelos animales como celulares, lo que indica que NPM promueve la fibrosis hepática.

La fibrosis hepática está regulada por varias células parenquimatosas y no parenquimatosas del hígado. La inmunotinción mostró que la NPM se expresaba en hepatocitos, colangiocitos y en varias células de la región de la vena porta, incluidas las HSC y las células de Kupffer. Especialmente en el hígado de ratón tratado con CCl4, la NPM se expresó fuertemente en el citoplasma de los hepatocitos lesionados que rodean la región portal, lo que sugiere que la NPM no se limita a las HSC para desempeñar un papel profibrótico.

El análisis mecanicista mostró que la NPM puede regular la fibrosis hepática a través del eje Akt/ROS de las HSC. La señalización de Akt regula la proliferación y supervivencia celular y desempeña un papel clave en la activación y el reclutamiento de células inflamatorias, activando así las HSC para promover la fibrosis hepática [38, 39]. Nuclear Akt interactúa con NPM y protege a NPM de la escisión proteolítica, mejorando así la supervivencia celular [29]. Nuestros resultados confirmaron que la NPM a su vez promueve la fosforilación de Akt. Se determinó además el efecto de Akt en las HSC y los resultados muestran que la inhibición de la señalización de Akt conduce a un aumento en el nivel de ROS, lo que promovió la apoptosis de las HSC. Además, la eliminación o inhibición de NPM en las HSC aumentó notablemente los niveles de ROS, lo que resultó en una mayor apoptosis, lo que confirma el eje de apoptosis NPM/Akt/ROS. Además, hemos confirmado que la NPM inhibe el exceso de ROS mediante la regulación positiva de la proteína antioxidante PRDX6, protegiendo así a las células de la apoptosis [34, 35]. Las ROS moderadas pueden activar las HSC, pero las ROS excesivas pueden promover la apoptosis [5, 40]. Por lo tanto, NPM disminuyó las ROS en las HSC activando Akt o regulando positivamente PRDX6, protegiendo así las HSC activadas de la apoptosis y promoviendo la fibrosis hepática.

Cabe señalar que aún no se conoce el mecanismo exacto por el cual la NPM regula la señalización de Akt, pero estudios previos han proporcionado algunas pistas. Los estudios han demostrado que la proteína NPM se une directamente al dominio PH de la proteína AKT fosforilada, y esta interacción es crucial para el efecto antiapoptótico de la NPM [29]. Además, se sabe que PI(3,4,5)P3 en la membrana se une al dominio PH de AKT para promover la fosforilación de AKT y prevenir su desfosforilación [41]. Teniendo en cuenta que la NPM tiene señales tanto nucleares como de localización nuclear y puede viajar entre el citoplasma y el núcleo, y se localiza principalmente en el nucléolo. Además, el PI (3,4,5) P3 nuclear compite con Akt para unirse preferentemente a NPM [42]. Por lo tanto, especulamos que la NPM puede promover la transducción de señales de AKT al influir en el proceso de nucleación, la estabilidad y la distribución de AKT fosforilada en el núcleo. Por un lado, la NPM citoplasmática se une al dominio PH de AKT para promover la nucleación de AKT fosforilada y también puede promover la estabilidad de AKT fosforilada. Por otro lado, la NPM entrante enriquece la AKT fosforilada en sitios específicos a través de su localización en el nucléolo, promoviendo así la acción de la AKT sobre sustratos específicos. La localización de Akt en el núcleo ayuda a limitar su especificidad de sustrato e inducir respuestas celulares específicas del contexto [41]. La hipótesis anterior todavía necesita mucha evidencia experimental para verificar su autenticidad.

El papel de NPM en la fibrosis hepática es mucho más complejo que el eje NPM/Akt/ROS/apoptosis en las HSC. En los resultados, la fosforilación de AKT está completamente bloqueada, mientras que los marcadores de cambio de fibrosis hepática son leves, lo que indica que otros factores están influyendo. Basándonos en la distribución similar de la proteína NPM y la proteína TGF-β2 en el tejido de fibrosis hepática, investigamos más a fondo la relación reguladora entre NPM y TGF-β2, la fuente de proteína TGF-β2 en los tejidos hepáticos, y su efecto sobre la fibrosis hepática. El análisis mecanicista confirmó que NPM reguló positivamente MIAT, que promovió la expresión de TGF-β2 al esponjar competitivamente miR-16-5p. El análisis de inmunotinción mostró que el TGF-β2 se expresaba principalmente en células de Kupffer, hepatocitos y HSC. Las células de Kupffer mostraron la mayor intensidad de tinción de TGF-β2. Sin embargo, considerando la superioridad numérica de los hepatocitos, es probable que el TGF-β2 en el hígado se derive principalmente de los hepatocitos lesionados. Además, los resultados de nuestro modelo de ratones sugieren que el TGF-β2 promueve la fibrosis inducida por CCl4. Estudios anteriores también confirmaron que el silenciamiento del TGF-β2 inhibía la fibrosis hepática de origen biliar [16]. Por lo tanto, como otra vía profibrótica de NPM en células de Kupffer, hepatocitos o HSC, NPM promueve la expresión y secreción de TGF-β2, activando así las HSC de manera paracrina o autocrina.

En particular, la NPM promueve la fibrosis hepática, pero no todos los inhibidores de la NPM pueden reducir la fibrosis hepática. CIGB300, que se une a NPM Ser125 e inhibe su fosforilación, inhibió la fibrosis hepática al regular negativamente la fosforilación de Akt. Pero otro inhibidor de la oligomerización de NPM, NSC348884 [28], cuyo mecanismo de inhibición de NPM aún se debate [43, 44], no inhibió significativamente la fibrosis hepática en ratones debido a su excesivo efecto proapoptótico sobre los hepatocitos además de las HSC (datos no mostrados). Por lo tanto, debido a la importancia de la NPM en la proliferación celular y la apoptosis, se deben considerar los posibles efectos secundarios de la inhibición de la NPM en el diseño de fármacos dirigidos a la NPM para inhibir la fibrosis hepática.

Cabe señalar que la metodología utilizada en este estudio muestra restricciones relevantes. La fibrosis inducida por CCl4 es un modelo artificial estandarizado y fácil de usar, que puede no ser suficiente para dilucidar completamente el mecanismo por el cual la NPM promueve la fibrosis. De hecho, no se observó una respuesta biliar significativa en la fibrosis hepática inducida por CCl4, pero se observó una reacción biliar significativa y una expresión positiva de la proteína NPM en células epiteliales biliares en micromatrices de enfermedad hepática humana (datos no mostrados), lo que sugiere que las células epiteliales biliares también pueden ser una fuente importante de TGF-β2. Además, otra restricción metodológica es la falta de ratones knockout condicionales para restringir los efectos a distintos tipos de células en el hígado, lo que se atribuye al hecho de que aún no se han establecido ratones knockout condicionales para las HSC. Por lo tanto, el mecanismo obtenido en el presente estudio se limita a la fibrosis hepática inducida por toxinas, y el mecanismo profibrótico de la NPM debe estudiarse más a fondo utilizando un modelo de fibrosis biliar en ratones knockout condicionales.

En conjunto, nuestros resultados demuestran que la NPM promueve la fibrogénesis hepática al inhibir la apoptosis inducida por Akt/ROS en HSC y regular positivamente el TGF-β2 inducido por Akt/MIAT en hepatocitos, células de Kupffer y HSC. La inhibición de NPM o la aplicación de un inhibidor de NPM atenuó notablemente la fibrosis hepática. La NPM sirve como posible nuevo objetivo farmacológico para la fibrosis hepática.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Wang FS, Fan JG, Zhang Z, Gao B, Wang HY. La carga global de enfermedades hepáticas: el mayor impacto de China. Hepatología. 2014;60:2099–108.

Artículo PubMed Google Scholar

Seki E, Schwabe RF. Inflamación hepática y fibrosis: vínculos funcionales y vías clave. Hepatología. 2015;61:1066–79.

Artículo PubMed Google Scholar

[PubMed] Safadi R, Friedman SL. Fibrosis hepática: papel de la activación de las células estrelladas hepáticas. Medscape Gen Med. 2002;4:27.

Google Académico

Blaner WS, O'Byrne SM, Wongsiriroj N, Kluwe J, D'Ambrosio DM, Jiang H, et al. Gotitas de lípidos de células estrelladas hepáticas: una gotita de lípidos especializada para el almacenamiento de retinoides. Biochim Biophys Acta. 2009;1791:467–73.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cichoz-Lach H, Michalak A. El estrés oxidativo como factor crucial en las enfermedades hepáticas. Mundo J Gastroenterol. 2014;20:8082–91.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Henderson NC, Iredale JP. Fibrosis hepática: mecanismos celulares de progresión y resolución. Ciencia clínica. 2007;112:265–80.

Artículo CAS Google Scholar

Friedman SL. Células estrelladas hepáticas: células proteicas, multifuncionales y enigmáticas del hígado. Physiol Rev. 2008;88:125–72.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gressner AM, Weiskirchen R. Los conceptos patogénicos modernos de la fibrosis hepática sugieren que las células estrelladas y el TGF-beta son los principales actores y objetivos terapéuticos. J Cell Mol Med. 2006;10:76–99.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lam S, Man K, Ng KTP, Fan ST, Lo CM. La importancia de la activación de las células estrelladas hepáticas en la lesión de injerto de hígado graso de tamaño pequeño. Transpl. de hígado 2005;11:C6–C.

Google Académico

Hernández-Gea V, Friedman SL. Patogenia de la fibrosis hepática. Annu Rev Pathol-Mech. 2011;6:425–56.

Artículo CAS Google Scholar

Herbertz S, Sawyer JS, Stauber AJ, Gueorguieva I, Driscoll KE, Estrem ST, et al. Desarrollo clínico de galunisertib (LY2157299 monohidrato), una molécula pequeña inhibidora de la vía de señalización del factor de crecimiento transformante beta. Droga Des Dev Ther. 2015;9:4479–99.

CAS Google Académico

Kirmaz C, Terzioglu E, Topalak O, Bayrak P, Yilmaz O, Ersoz G, et al. Factor de crecimiento transformante sérico beta1 (TGF-beta1) en pacientes con cirrosis, hepatitis B crónica y hepatitis C crónica [corregido]. Eur Cytokine Netw. 2004;15:112–6.

CAS PubMed Google Académico

Bissell DM, Wang SS, Jarnagin WR, Roll FJ. Expresión celular específica del factor de crecimiento transformante beta en hígado de rata: evidencia de la regulación autocrina de la proliferación de hepatocitos. J Clin invertir. 1995;96:447–55.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dropmann A, Dediulia T, Breitkopf-Heinlein K, Korhonen H, Janicot M, Weber SN, et al. Abundancia de TGF-beta1 y TGF-beta2 en enfermedades hepáticas de ratones y hombres. Oncoobjetivo. 2016;7:19499–518.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun TH, Huang ZY, Liang WC, Yin JP, Lin WY, Wu J, et al. Las isoformas de TGF beta 2 y TGF beta 3 impulsan la patogénesis de la enfermedad fibrótica. Ciencia Transl Med. 2021;13:eabe0407.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dropmann A, Dooley S, Dewidar B, Hammad S, Dediulia T, Werle J, et al. Silenciamiento de TGF-beta2 para atacar enfermedades hepáticas de origen biliar. Intestino. 2020;69:1677–90.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Huang N, Negi S, Szebeni A, Olson MO. La proteína NPM3 interactúa con la proteína nucleolar multifuncional B23/nucleofosmina e inhibe la biogénesis de los ribosomas. J Biol Chem. 2005;280:5496–502.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dutta S, Akey IV, Dingwall C, Hartman KL, Laue T, Nolte RT, et al. La estructura cristalina del núcleo de nucleoplasmina: implicaciones para la unión de histonas y el ensamblaje de nucleosomas. Celda Mol. 2001;8:841–53.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Okuda M. El papel de la nucleofosmina en la duplicación del centrosoma. Oncogén. 2002;21:6170–4.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kondo T, Minamino N, NagamuraInoue T, Matsumoto M, Taniguchi T, Tanaka N. Identificación y caracterización de nucleofosmina/B23/numatrina que se une al factor de transcripción antioncogénico IRF-1 y manifiesta actividad oncogénica. Oncogén. 1997;15:1275–81.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hsu CY, Yung BYM. La sobreexpresión de nucleofosmina/B23 disminuye la susceptibilidad de las células HL-60 de leucemia humana a la diferenciación y apoptosis inducida por el ácido retinoico. Int J Cáncer. 2000;88:392–400.

3.0.CO;2-7" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1097-0215%2820001101%2988%3A3%3C392%3A%3AAID-IJC11%3E3.0.CO%3B2-7" aria-label="Article reference 21" data-doi="10.1002/1097-0215(20001101)88:33.0.CO;2-7">Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ye KQ. Nucleofosmina/B23, una proteína multifuncional que puede regular la apoptosis. Cáncer Biol Ther. 2005;4:918–23.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Grisendi S, Mecucci C, Falini B, Pandolfi PP. Nucleofosmina y cáncer. Rev. Nacional. Cáncer. 2006;6:493.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tsui KH, Cheng AJ, Chang P, Pan TL, Yung BY. Asociación de la expresión del ARNm de nucleofosmina/B23 con el resultado clínico en pacientes con carcinoma de vejiga. Urología. 2004;64:839–44.

Artículo PubMed Google Scholar

Perera Y, Farina HG, Gil J, Rodríguez A, Benavent F, Castellanos L, et al. El péptido anticancerígeno CIGB-300 se une a la nucleofosmina/B23, altera su fosforilación mediada por CK2 y conduce a la apoptosis a través de su actividad de desensamblaje nucleolar. Mol Cáncer Ther. 2009;8:1189–96.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

[Artículo gratuito de PMC] [PubMed] Sato Y, Murase K, Kato J, Kobune M, Sato T, Kawano Y, et al. Resolución de la cirrosis hepática mediante liposomas acoplados a vitamina A para administrar ARNip contra una chaperona específica del colágeno. Nat Biotecnología. 2008;26:431–42.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Peng B, Liu F, Han R, Luo G, Cathopoulis T, Lu K, et al. El cambio metabólico dinámico es indicativo de la transformación de las células hepáticas inducida por la inflamación. Int J Biochem Cell B. 2015;66:45–58.

Artículo CAS Google Scholar

Di Matteo A, Franceschini M, Chiarella S, Rocchio S, Travaglini-Allocatelli C, Federici L. Moléculas dirigidas a la nucleofosmina para el tratamiento del cáncer: una actualización. Oncoobjetivo. 2016;7:44821–40.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee SB, Xuan Nguyen TL, Choi JW, Lee KH, Cho SW, Liu Z, et al. Nuclear Akt interactúa con B23/NPM y lo protege de la escisión proteolítica, mejorando la supervivencia celular. Proc Natl Acad Sci Estados Unidos. 2008;105:16584–9.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramos-Tovar E, Muriel P. Mecanismos moleculares que vinculan el estrés oxidativo, la inflamación y la fibrosis en el hígado. Antioxidantes. 2020;9:1279.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao Y, Hu XB, Liu YJ, Dong SM, Wen ZW, He WM, et al. Señalización de ROS bajo estrés metabólico: interferencia entre la vía AMPK y AKT. Cáncer de Mol. 2017;16:79.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Locasale JW, Cantley LC. Flujo metabólico y regulación del crecimiento de células de mamíferos. Metabolismo celular. 2011;14:443–51.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gorrini C, Harris IS, Mak TW. Modulación del estrés oxidativo como estrategia anticancerígena. Descubrimiento de medicamentos de Rev Nacional. 2013;12:931–47.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Liu GY, Shi JX, Shi SL, Liu F, Rui G, Li X, et al. La nucleofosmina regula la homeostasis del estrés oxidativo intracelular a través del antioxidante PRDX6. Bioquímica de células J. 2017;118:4697–707.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wang D, Li Y, Liu Y, Cheng S, Liu F, Zuo R, et al. NPM1 promueve la proliferación celular al atacar PRDX6 en el cáncer colorrectal. Int J Biochem Cell Biol. 2022;147:106233.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Roehlen N, Crouchet E, Baumert TF. Fibrosis hepática: conceptos mecanicistas y perspectivas terapéuticas. Células. 2020;9:875.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bijkerk R, Au YW, Stam W, Duijs JMGJ, Koudijs A, Lievers E, et al. Los ARN largos no codificantes Rian y Miat median la formación de miofibroblastos en la fibrosis renal. Frente Farmacéutico. 2019;10:215.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aleffi S, Petrai I, Bertolani C, Parola M, Colombatto S, Novo E, et al. Regulación positiva de citocinas proinflamatorias y proangiogénicas por la leptina en células estrelladas hepáticas humanas. Hepatología. 2005;42:1339–48.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bataller R, Paik YH, Lindquist JN, Lemasters JJ, Brenner DA. El núcleo del virus de la hepatitis C y las proteínas no estructurales inducen efectos fibrogénicos en las células estrelladas hepáticas. Gastroenterología. 2004;126:529–40.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kaminskyy VO, Zhivotovsky B. Radicales libres en la conversación cruzada entre autofagia y apoptosis. Señal redox antioxidante. 2014;21:86–102.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yudushkin I. Control de la actividad de Akt y fosforilación del sustrato en las células. Vida IUBMB. 2020;72:1115–25.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kwon IS, Lee KH, Choi JW, Ahn JY. PI(3,4,5)P3 regula la interacción entre Akt y B23 en el núcleo. Representante de BMB 2010;43:127–32.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Qi W, Shakalya K, Stejskal A, Goldman A, Beeck S, Cooke L, et al. NSC348884, un inhibidor de la nucleofosmina, interrumpe la formación de oligómeros e induce la apoptosis en células cancerosas humanas. Oncogén. 2008;27:4210–20.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sasinkova M, Herman P, Holoubek A, Strachotova D, Otevrelova P, Grebenova D, et al. La citotoxicidad de NSC348884 no está mediada por la inhibición de la oligomerización de nucleofosmina. Representante científico 2021;11:1084.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81670542, 82273044), el Proyecto (clave) de Guía de Desarrollo Social Provincial de Fujian (2021Y0001) y el Proyecto de la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Fujian (2021J011351).

Estos autores contribuyeron igualmente: Xue Ding, Xin-Le Zhu, Dong-Hui Xu, Shuang Li, Qiong Yang.

Centro de Investigación del Cáncer, Facultad de Medicina, Universidad de Xiamen, Xiamen, China

Xue Ding, Xin-Le Zhu, Dong-Hui Xu, Shuang Li, Qiong Yang, Xian Feng, Yong-Gui Wei, Huan Li, Ling Yang, Xiao-Ling Deng y Song-Lin Shi

Departamento de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina, Universidad de Xiamen, Xiamen, China

Xue Ding, Xin-Le Zhu, Yu-Jun Zhang y Song-Lin Shi

Departamento de Cirugía Vascular Hepático, Biliar y Pancreático, Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Xiamen, Facultad de Medicina, Universidad de Xiamen, Xiamen, China

Dong Hui Xu

Hospital Xiang'an de la Universidad de Xiamen, Facultad de Medicina, Universidad de Xiamen, Xiamen, China

Kuan Can Liu

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

El trabajo de los autores en este estudio se enumera a continuación: Modelo animal y análisis histopatológico XD y XLZ. Análisis MIAT y ensayo indicador de luciferasa dual SL, análisis RNA-seq SL, prueba WB QY, XLZ, XF, YGW, HL y YL; PCR SL, QY y XLZ en tiempo real; y análisis de microarrays de tejidos DHX, YJZ, XD y XLZ. Aislamiento de células primarias XLZ y SLS. Detección de ROS y apoptosis XD y XF. Datos analizados por KCL y XLD. SLS diseñó y supervisó el estudio y escribió el manuscrito.

Correspondencia a Kuan-Can Liu o Song-Lin Shi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Editado por Boris Zhivotovsky

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ding, X., Zhu, XL., Xu, DH. et al. La NPM promueve la fibrosis inducida por hepatotoxina al inhibir la apoptosis de las células estrelladas hepáticas inducida por ROS y regular positivamente el TGF-β2 inducido por lncMIAT. Muerte celular Dis 14, 575 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-06043-0

Descargar cita

Recibido: 20 de febrero de 2023

Revisado: 25 de julio de 2023

Aceptado: 04 de agosto de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-023-06043-0

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt