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Feb 07, 2024

Complejos de polipiridilo de metal (II) dinuclear y mononuclear contra fármacos

Malaria Journal volumen 21, Número de artículo: 386 (2022) Citar este artículo 1423 Accesos 2 Detalles de Altmetric Metrics La malaria sigue siendo una de las enfermedades parasitarias más virulentas y mortales del mundo.

Malaria Journal volumen 21, Número de artículo: 386 (2022) Citar este artículo

1423 Accesos

2 altmétrico

Detalles de métricas

La malaria sigue siendo una de las enfermedades parasitarias más virulentas y mortales del mundo, particularmente en África y el Sudeste Asiático. La aparición generalizada de cepas de Plasmodium falciparum resistentes a la artemisinina en la subregión del Gran Mekong es alarmante. Esto obstaculiza las economías nacionales, además de ser un gran inconveniente para el control y la eliminación eficaces de la malaria en todo el mundo. Es evidente que se necesita con urgencia un fármaco antipalúdico eficaz.

Los complejos dinucleares y mononucleares de cobre (II) y zinc (II) se sintetizaron en solución etanólica y se caracterizaron mediante diversas mediciones físicas (FTIR, análisis elemental CHN, solubilidad, ESI-MS, UV-Visible, conductividad y momento magnético, y RMN). . Se determinó mediante rayos X la estructura cristalina del complejo de dicobre(II). Las actividades hemolíticas in vitro de estos complejos metálicos se evaluaron espectroscópicamente en sangre B+, mientras que la potencia antipalúdica se realizó in vitro en Plasmodium falciparum 3D7 (Pf3D7) sensible a los medicamentos en etapa sanguínea y Plasmodium falciparum IPC5202 (Pf5202) resistente a la artemisinina con tinte fluorescente. . Se llevó a cabo el modo de acción de los complejos metálicos para determinar la formación de especies reactivas de oxígeno usando tintes PNDA y DCFH-DA, despolarización JC-1 del potencial de membrana mitocondrial, inhibición del proteosoma 20S de malaria con lisado de parásito y estudios morfológicos usando tinciones de Giemsa y Hoechst.

Los complejos de cobre (II) mostraron potencia antipalúdica contra Pf3D7 y Pf5202 en un rango submicromolar a micromolar. Los complejos de zinc (II) fueron eficaces contra Pf3D7 con un índice terapéutico excelente, pero encontraron una resistencia total contra Pf5202. Entre los cuatro, el complejo dinuclear de cobre (II) fue el más potente contra ambas cepas. Los complejos de zinc (II) no causaron hemólisis de los glóbulos rojos, mientras que los complejos de cobre (II) indujeron una mayor hemólisis al aumentar la concentración. Otros estudios mecanicistas de ambos complejos de cobre (II) en las cepas Pf3D7 y Pf5202 mostraron inducción de ROS, inhibición del proteasoma de la malaria 20S, pérdida del potencial de membrana mitocondrial y características morfológicas indicativas de apoptosis.

El dinuclear [Cu(phen)-4,4′-bipy-Cu(phen)](NO3)4 es muy potente y puede superar la resistencia total al fármaco de Pf5202 hacia la cloroquina y la artemisinina. Los otros tres complejos de cobre (II) y zinc (II) solo fueron efectivos contra el Pf3D7 sensible a los fármacos, y este último no provocó hemólisis de los glóbulos rojos. Su modo de acción involucra múltiples objetivos.

La OMS informó aproximadamente 241 millones de casos de malaria en todo el mundo en 85 países endémicos, con una estimación de muertes por malaria de 627.000 en 2020 [1]. La situación se ve agravada por la propagación de la resistencia a los medicamentos, incluso a la terapia combinada basada en artemisinina (ACT), y la aparición independiente de mutaciones kelch13, que es la causa de la resistencia a la artemisinina [2]. Debido a la creciente eliminación de más miembros en el cóctel de medicamentos en ACT, como resultado de la resistencia a los medicamentos, existe una necesidad urgente de descubrir nuevos medicamentos antipalúdicos.

El desarrollo de complejos metálicos es un diseño de fármaco alternativo atractivo debido a las posibilidades estructurales y fisicoquímicas únicas que las moléculas orgánicas no pueden lograr, y estos fármacos metálicos contra la malaria ofrecen una solución potencial a la resistencia a los medicamentos [3,4,5,6,7] . Entre los cuatro complejos catiónicos de ligandos mixtos, (N-benzoil-N′,N′-di(2-hidroxietil)tioureato)(4,4′-di-terc-butil-2,2′-bipiridil)platino(II) El cloruro fue fuertemente activo contra las cepas de malaria tanto sensibles como resistentes a la cloroquina [8]. De la lista de diferentes complejos de metal-cloroquina, tres de los seis probados mostraron una mayor actividad antipalúdica contra las cepas de malaria resistentes a la cloroquina [9]. En otro estudio, la potencia de uno de los complejos de cobre (II) probados fue 32 veces mayor que la de la cloroquina y 260 veces mayor que la de otro fármaco antiprotozoario, el toltrazuril, lo que sugiere que los complejos de cobre son buenos candidatos [3]. En comparación, un compuesto líder [(η5-C5R5)Ru(PPh3)(phen)][PF6] era sólo menos de 2 veces más potente que la cloroquina en Pf3D7, una cepa de Plasmodium falciparum sensible a cloroquina/artemisinina, pero era no es tan bueno como la cloroquina o la dihidroartemisinina contra la cepa Pf5202 resistente a la artemisinina [7].

Además de los complejos de cobre (II), los complejos de zinc son atractivos debido a su baja o nula toxicidad. Sin embargo, la formación de complejos de zinc (II) con ligandos bioactivos puede mejorar su propiedad antipalúdica, pero no siempre es comparable a otros fármacos antipalúdicos [10, 11]. Hasta ahora, los complejos metálicos contra la malaria son en su mayoría mononucleares. Sin embargo, a pesar de que se sabe que algunos complejos de dicobre (II) y dizinc (II) tienen propiedades anticancerígenas, no parece haber ningún informe sobre sus propiedades antipalúdicas [12,13,14,15]. En este documento, el manuscrito informa sobre la síntesis y caracterización de dos complejos de metal dinuclear (II) (Cu y Zn) con una 1,10-fenantrolina (fen) bioactiva y una 4,4'-bipiridina (4,4'-) no bioactiva. bipy) como ligando puente, y su propiedad antipalúdica, en comparación con sus respectivos complejos mononucleares de metal (II) que contienen dos ligandos fen.

Los materiales de partida o productos químicos disponibles comercialmente eran de calidad de reactivo analítico y de la mayor pureza disponible. Todos se utilizaron tal como se recibieron sin purificación adicional. Productos químicos: 1,10-fenantrolina (Acros Organics, EE. UU.), 4,4′-bipiridina (Merck, Alemania), nitrato de cobre (II) trihidrato (Alfa Aesar, EE. UU.) y nitrato de zinc (II) hexahidrato (Acros Organics, Bélgica) ). Toda la cristalería se lavó minuciosamente con agua regia diluida, luego con agua ultrapura y se secó durante la noche en un horno. Todos los complejos de metal (II) sintetizados se recogieron mediante filtración por succión, se lavaron con etanol frío, se secaron en un horno y se mantuvieron en un desecador que contenía gel de sílice antes de la caracterización. Todas las soluciones madre tampón para ensayos biológicos se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

El par de [M(fen)2](NO3)2 (M = cobre o zinc) se sintetizaron de la misma manera que se describe en el presente documento. Se añadió una solución de 1,10-fenantrolina a una solución etanólica de sal de nitrato metálico (II) (30 ml de agua:etanol 1:1 v/v). Después de calentarse y agitarse continuamente (55 °C; 525 rpm) durante 2 h, cada solución se filtró y produjo un precipitado al evaporarse lentamente.

[Cu(phen)2](NO3)2·H2O (1) Color (% Rendimiento): Verde (70,28%). FTIR (ATR) cm−1: 3188 (νs (OH) br), 3061 (frente a (CH) m), 1429–1608 (frente a (C = C) m), fen: 850 y 720 (frente a (CNC) m ). Análisis Elemental: Anal. Calc. para CuC24H18N6O7: C, 50,93%; H, 3,21%; N, 14,85%. Encontrado: C, 50,67%; H, 3,04%; N, 15,12%. Momento magnético, µeff en BM: 1,84. ESI-MS(+) en metanol acuoso: m/z 484,8 (100%), 486,7 (49%) (calculado m/z para [63Cu(phen)2(NO3)]+, 485,3; [65Cu(phen)2(NO3)]+, 485,3; )2(NO3)]+, 487,1).

[Zn(fen)2](NO3)2·2H2O (2). Color (% Rendimiento): Blanco (73,74%). FTIR (ATR) cm−1: 3180 (νs (OH) br), 3062 (frente a (CH) m), 1495–1581 (frente a (C = C) m), fen: 846 y 723 (frente a (CNC) m ).—RMN 1H (400 MHz, DMSO-d, δ ppm): 8,049 (4H, t, Ar-H); 8,320 (4H, s, Ar-H); 8,733 (4H, d, Ar-H); 8,945 (4H, d, Ar-H). RMN 13C (400 MHz, DMSO-d, δ ppm): 126,640 (CAr); 128.022 (CAr); 129.605 (CAr); 140.284 (CAr); 140,941 (-CAr = N); 149.608 (-CAr-N). Análisis Elemental: Anal. Calc. para ZnC24H20N6O8: C, 49,20%; H, 3,44%; N, 14,35%. Encontrado: C, 49,11%; H, 2,89%; N, 14,33%. Momento magnético, µeff en BM: 0,30. ESI-MS(+) en metanol acuoso: m/z 485,9 (67%), 487,9 (40%) (calculado m/z para [64Zn(phen)2(NO3)]+, 486,3;[66Zn(phen) )2(NO3)]+, 488,3).

Se disolvió [Cu(fen)](NO3)2 (0,7355 g, 2 mmol) en una solución de agua:etanol 1:1 v/v y se añadió una solución etanólica de 4,4'-bipiridina (0,1560 g, 1 mmol). en la solución del complejo de cobre. Se añadió más etilendiamina (66,85 µl, 1 mmol) a la mezcla. La mezcla se calentó y se agitó a 50 °C, 700 rpm durante 2 h. Luego la solución se calentó en un baño de agua durante 5 h y se dejó evaporar a temperatura ambiente. Se formaron cristales de color verde oscuro después de 2 días. Los cristales se filtraron y recristalizaron con una solución de agua:etanol 1:2 v/v. Luego los cristales recristalizados se filtraron y se secaron en una estufa a 55 °C durante la noche.

[Cu(phen)(NO3)(H2O)-4,4′-bipy-Cu(phen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (3). Color (% Rendimiento): Verde (35,69%). FTIR (ATR) cm-1: bipy: 1610 (frente a (C = C) m), 1026 (frente a (flexión en el plano de piridilo) m), fen: 856 y 721 (frente a (CNC) m). Análisis Elemental: Anal. Calc. para Cu2C34H28N10O14: C, 44,02%; H, 3,04%; N, 15,10%. Encontrado: C, 44,17%; H, 2,82%; norte, 14,95%. Momento magnético, µeff en BM: 1,37. ESI-MS(+) en dimetilsulfóxido acuoso: m/z 237,9 (100%), 382,2 (30,9%) (calculado m/z para [63Cu(phen)-4,4'-bipy-63Cu(phen) (NO3) + 3H]3+, 237,8; [63Cu(fen)(NO3)-4,4′-bipy-63Cu(fen)-(NO3)-H]2+, 382,2).

Se añadió 4,4'-bipiridina (10 ml de etanol al 95%; 0,1571 g; 1 mmol) a una solución etanólica de nitrato de zinc (II) hexahidrato (10 ml de etanol al 95%; 0,6147 g; 2 mmol). La solución se calentó y se agitó a 55 °C, 700 rpm durante 30 a 45 min. Se disolvió 1,10-fenantrolina (10 ml de etanol al 95%; 0,3604 g; 2 mmol) y se vertió en la mezcla calentada. La solución se calentó más y se agitó a 55 °C, 700 rpm durante 2 h. Comenzó a formarse un polvo blanco mientras se revolvía en un plato caliente. El polvo se recogió mediante filtración por succión, se lavó con etanol enfriado con hielo y se secó durante la noche en el horno.

[Zn(phen)(NO3)-4,4′-bipy-Zn(phen)(NO3)](NO3)2·2H2O (4). Color (% Rendimiento): Blanco (16,64%). FTIR (ATR) cm-1: bipy: 1610 (frente a (C = C) m), 1026 (frente a (flexión en el plano de piridilo) m), fen: 848 y 725 (frente a (CNC) m). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d, δ ppm): 7,396 (4H, d, Ar-H); 8,123 (4H, t, Ar-H); 8,245 (4H, s, Ar-H); 8,698 (4H, d, Ar-H); 8,894 (4H, t, Ar-H); 9,128 (4H, d, Ar-H). RMN 13C (400 MHz, DMSO-d, δ ppm): 126,219–129,576 (CAr); 139,893–140,436 (CA); 140,903 (= CAr-N); 144.927 (-CAr-N); 149.580 (-CAr-CAr); 151,010 (-CAr=N). Análisis Elemental: Anal. Calc. para Zn2C34H28N10O14: C, 43,84%; H, 3,03%; N, 15,04%. Encontrado: C, 43,80%; H, 3,44%; N, 14,71%. Momento magnético, µeff en BM: 1,06. ESI-MS( +) en dimetilsulfóxido acuoso: m/z 383,6 (100%) (calculado para [64Zn(phen)(NO3)-4,4′-bipy-64Zn(phen)(NO3)]2+ , 384,2).

Los espectros FTIR del complejo de metal (II) se registraron con un Shimadzu IRAffinity-1S en un rango de 400 a 4000 cm-1. El análisis elemental de carbono, hidrógeno y nitrógeno se llevó a cabo en un Perkin Elmer CHNS/O 2400 Serie II de la Universiti Malaya (UM). Los espectros de RMN se obtuvieron con un espectrómetro FT-NMR ECX 400 (400 MHz) utilizando dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) como disolvente sin referencia interna (Universiti Malaya).

La solubilidad de los complejos de metal (II) se determinó utilizando diferentes tipos de disolventes, es decir, agua bidestilada, etanol al 95%, metanol y dimetilsulfóxido (DMSO). Los espectros de masas de ionización por electropulverización de iones positivos (ESI-MS) de aproximadamente 200 ng/μL de (i) complejos de metal mononuclear (II) disueltos en agua-metanol (1:4 v/v) y (ii) dimetal ( II) se obtuvieron complejos en agua-dimetilsulfóxido (9:1 v/v) utilizando el espectrómetro de masas Thermo Finnigan LCQ (Universidad Nacional de Singapur) mediante el método de infusión (10 μL/min) con temperatura capilar calentada a 60 °C y voltaje capilar de 21V.

La medición espectroscópica visible se llevó a cabo en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 25 con una cubeta de cuarzo de trayectoria óptica de 1 cm en el rango de 200 a 400 cm −1 para el rango ultravioleta (UV) y de 400 a 1000 cm −1 para el rango visible (Vis). . Se utilizó un conductímetro de mesa EUTECH Instruments PC 2700 para medir la conductividad de una solución de complejo de metal (II). La susceptibilidad magnética se determinó con una balanza de susceptibilidad magnética Sherwood Scientific MK 1 a temperatura ambiente.

Los complejos de metal (II) (1) y (2) se disolvieron en agua bidestilada (dd-agua) y se diluyeron aún más con dd-agua para estudios de caracterización, mientras que se diluyeron aún más con medio para estudios biológicos. Por otro lado, los complejos de metal (II) (3) y (4) se disolvieron en DMSO y se diluyeron adicionalmente con dd-agua para estudios de caracterización mientras se diluían con medio para estudios biológicos.

Se recogieron datos de intensidad para un cristal de bloque verde, 0,40 × 0,30 × 0,20 mm de cobre (II) (3) a 293 K (20 °C) montando el cristal sobre fibra de cuarzo en un difractómetro SuperNova Dual de Agilent Technologies con detector Atlas. , utilizando una radiación de Supernova Cu Kα (λ = 1,54184 Å). Se utilizó el software Agilent CrysAlis PRO para la adquisición y reducción de datos. La solución estructural se realizó con el conjunto de programas SHELXTL [16]. La estructura se resolvió mediante métodos directos para localizar los átomos pesados, seguidos de mapas de diferencias para los átomos ligeros que no son de hidrógeno. Todos los átomos distintos de hidrógeno se refinaron con parámetros térmicos anisotrópicos y se refinaron mediante un procedimiento de mínimos cuadrados de matriz completa utilizando Olex [17]. La estructura molecular del complejo (3) se muestra en la Fig. 1. Los datos cristalográficos se resumen en el archivo adicional 1: Tabla S1 y se depositaron en el Centro Cristalográfico de Cambridge (CCDC No. 2158992) que se puede obtener de http:// www.ccdc.cam.ac.uk/Community/Request a Structure/Pages/Data Request.aspx. Las distancias y ángulos de unión seleccionados se tabulan en el archivo adicional 1: Tabla S2.

Gráfico de Ortep del complejo de dicobre (II) (3) con átomos no de hidrógeno marcados (no se muestran dos aniones de nitrato no coordinados)

Se prepararon series de soluciones madre de 10 mM disolviendo los compuestos en sus respectivos disolventes: fen y 4,4′-bipy en etanol al 95%; Cu(NO3)2·3H2O, Zn(NO3)2·6H2O, (1) y (2) en agua bidestilada; (3) y (4) en DMSO. Todas las soluciones madre se diluyeron aún más con agua bidestilada para obtener 10 ml de 30 µM, 1 mM y 5 mM para sus respectivos estudios, a saber. 30 µM para estudios espectrales ultravioleta, 1 mM para medición de conductividad y 5 mM para estudios espectrales visibles. Para las soluciones de agua-DMSO de ambos complejos (3) y (4), las soluciones de 30 µM, 1 mM y 5 mM tienen 3% de DMSO, 10% de DMSO y 50% de DMSO respectivamente. La absorbancia en λmax y la conductancia de las soluciones acuosas se midieron a las 0, 24, 48 y 72 h. Luego se calcularon la absortividad molar y la conductividad molar de las soluciones del complejo de metal (II) y sus precursores.

La cepa sensible a los medicamentos de P. falciparum 3D7 (Pf3D7) se obtuvo del Departamento de Ciencias de la Universidad de Monash, Malasia, y se cultivó como se describió anteriormente [18]. La cepa resistente a la artemisinina de P. falciparum IPC5202 (Pf5202) se obtuvo de BEI Resources y se cultivó como se menciona en la ficha del producto. Ambas cepas se mantuvieron en matraces sellados a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% O2, 5% CO2 y 90% N2. Todas las soluciones madre tampón para ensayos biológicos se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Se lavó sangre B+ fresca con medio RPMI1640 que contenía 30 µg/ml de gentamicina (Gibco) y se centrifugó a 1000 xg durante 10 minutos tres veces. El porcentaje de hemólisis se determinó espectroscópicamente usando un compuesto de prueba que contenía un 5% de hematocrito en una concentración creciente y se incubó durante 72 h a 37 °C [19, 20]. La sangre no tratada actuó como control negativo mientras que la sangre tratada con agua destilada estéril actuó como control positivo (para 100% de hemólisis).

Se utilizó un ensayo antipalúdico previamente informado con ligeras modificaciones utilizando parasitemia al 1% (etapa de anillo) y hematocrito al 5% tratados con compuestos de prueba en concentraciones crecientes e incubados durante 72 h a 37 °C [21,22,23]. Después de la incubación, el ensayo se terminó mediante un ciclo de congelación/descongelación (-80 °C durante la noche antes de descongelar durante 2 h) antes de agregar el tampón de lisis que contenía el tinte SYBR Green I en cada pocillo y se mezcló completamente usando la bailarina del vientre durante 30 minutos en la oscuridad. Como fármacos estándar se utilizaron sal de difosfato de cloroquina y artemisinina. La señal de fluorescencia se cuantificó a una longitud de onda de excitación de 485 nm y a una longitud de onda de emisión de 528 nm. Los valores de CI50 de cada compuesto de prueba se determinaron a partir de una curva dosis-respuesta mediante análisis de regresión no lineal.

Se utilizó un ensayo espectrométrico previamente informado utilizando PNDA para cuantificar la cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS), a saber. •Radicales OH, producidos por la reacción de complejos de metal (II) con peróxido de hidrógeno en tampón borato a pH 7,5 [24,25,26]. Se determinó el porcentaje de blanqueo con PNDA y la concentración de •OH producido.

Se utilizó un procedimiento publicado previamente con ligeras modificaciones para la determinación del nivel de ROS intracelular en parásitos P. falciparum [27]. Brevemente, los glóbulos rojos parasitados se trataron con compuestos de prueba durante 24, 48 y 72 h a 37 °C. Después de la incubación, las células empaquetadas se lavaron con solución salina tampón fosfato (PBS). Posteriormente, se añadió una solución de PBS que contenía 10 µM de DCFH-DA y se incubó a 37 °C durante 30 minutos en la oscuridad, antes de que se registraran las intensidades de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 485 nm y de emisión de 535 nm. Los datos se expresaron como el cambio entre la cantidad de ROS producida por P. falciparum tratado frente a P. falciparum no tratado. La normalización se realizó con el porcentaje de viabilidad del parásito obtenido en cada condición. Se utilizó peróxido de hidrógeno como control positivo.

Para recolectar parásitos P. falciparum, se recolectaron Pf3D7 y Pf5202 intraeritrocíticos en trofozoítos y estadios tempranos de esquizontes. Los glóbulos rojos se lisaron en tampón de lisis de saponina al 0,15% (p/v) durante 10 minutos a 37 °C. Después de la lisis, el sedimento del parásito se lavó una vez con tampón PBS centrifugando a 1600 rpm durante 5 minutos. Se añadió tampón de lisis de saponina una vez más para eliminar todos los glóbulos rojos durante 10 minutos a 37 °C, seguido de lavado con PBS dos veces y se usó inmediatamente o se mantuvo a -80 °C. Para preparar lisados ​​de parásitos para la purificación del proteasoma, el sedimento del parásito se resuspendió con 100 µl de tampón Pierce™ RIPA preenfriado. Se utilizó un método de extracción de proteínas suave para preparar extractos de parásitos. Los parásitos resuspendidos se pasaron 20 veces a través de una aguja con un diámetro de 0,4 mm en una jeringa sobre hielo para lisar el parásito. Después de 15 minutos de centrifugación a 13.000 xg a 4 °C, se eliminó el sobrenadante. La concentración de proteínas se determinó mediante el ensayo de Bradford [28]. Las actividades de 3 sitios proteolíticos se determinaron mediante ensayo de fluorescencia utilizando sustratos peptídicos fluorogénicos (Suc-LLVY-AMC para tipo quimotripsina, Boc-LRR-AMC para tipo tripsina y Suc-LLE-AMC para tipo caspasa) [24,25 ,26, 29] Las actividades del proteasoma se determinaron monitoreando la hidrólisis del sustrato durante 30 minutos a 37 °C con una longitud de onda de excitación de 340 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm. Se calculó la actividad de cada sitio proteolítico y los valores de CI50 se determinaron a partir del análisis de regresión no lineal. Se utilizó el inhibidor del proteasoma VR23 como control positivo.

El potencial de membrana mitocondrial se investigó utilizando un kit JC-1 de detección de potencial de membrana mitocondrial por citometría de flujo MitoScreen BD™. En resumen, se trataron glóbulos rojos parasitados con compuestos de prueba en las concentraciones deseadas durante 12 y 48 h a 37 °C. Después de la incubación, las células empaquetadas se tiñeron según las instrucciones del fabricante [30]. La disipación en Δψm se midió calculando la relación entre la fluorescencia roja y verde.

Las detecciones de características morfológicas hemolíticas y apoptóticas se examinaron en un frotis de sangre fino teñido con Giemsa. Luego se visualizó el parásito mediante inmersión en aceite (aumento de 100 ×) utilizando un microscopio vertical de campo claro. Se preparó otra extensión fina de sangre, se fijó con metanol, se tiñó con 10 µg/mL de tinción Hoechst 33,258 y se mantuvo en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente [31]. Se aplicó un cubreobjetos y luego se visualizó el examen morfológico nuclear con un aumento de 100 × con aceite mediante un microscopio de fluorescencia utilizando un filtro DAPI.

Todos los [Cu(phen)2(H2O)](NO3)2 (1), [Zn(phen)2(H2O)2)](NO3)2 (2), [Cu(phen)(NO3)(H2O) )]-4,4′-bipy-[Cu(phen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (3), y [Zn(phen)(NO3)(H2O)-4,4′-bipy- Los complejos Zn(fen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (4) contienen dos ligandos fen coordinados, con uno o dos fen coordinados con el mismo átomo metálico. Todos los productos sólidos eran notablemente estables al aire. Las fórmulas propuestas de (1) a (4) están respaldadas por análisis elementales. La estructura cristalina del complejo mononuclear de cobre (II) (1) se ha informado previamente con una molécula de agua quelada y dos ligandos fen y con una geometría de bipirámide trigonal distorsionada alrededor del átomo de cobre [32]. En el presente documento se informa la estructura del complejo con puente dicobre (II) 4,4′-bipy (3) (Fig. 1). La estructura de 3 es similar a las informadas anteriormente [33, 34]. El entorno alrededor de cada átomo de cobre (II) en (3) es un octaedro distorsionado, con Cu-N1(fen), Cu-N2(fen), Cu-N3(amino-4,4'-bipy), Cu-O1 (OH2), Cu-O6(ONO2) y Cu-O5(ONO2) distancias de enlace de 2.028, 2.016, 1.986, 2.224, 1.994 y 2.707 Ǻ (archivo adicional 1: Tabla S2). Todos los complejos (1) – (4) exhiben dos picos en sus espectros FTIR en el rango de 846–856 y 720–725 cm−1, que se atribuyen a las vibraciones ν (CNC) del fen coordinado [35]. La presencia de 4,4′-bipy en los complejos (3) y (4) está indicada por dos picos a 1610 y 1026 cm-1 en sus espectros FTIR [36]. La estructura sólida del complejo de zinc (II) (2) se desconoce, pero lo más probable es que sea octaédrica, como la del [Zn(fen)2(H2O)2]L (L = fumarato) [37]. La estructura del complejo de dizinc (II) (4) puede ser similar a (3), a diferencia de la informada para catena-poli[diaqua(1,10-fenantrolina-κ2N,N′)zinc(II)]-μ-4 ,4′-bipiridina-κ2N,N'] dinitrato 4,4′-bipiridina hemisolvato monohidrato [38]. Además, la presencia de ligandos fen y 4,4'-bipy en los complejos de Zn (II) (2) y (4) se valida mediante datos espectrales de RMN 1H y 13C (archivo adicional 1: Figuras S1.1 a S2 .2). Las estructuras ChemDraw de (1) a (4) se muestran en la Fig. 2.

Estructuras ChemDraw de (1) a (4) en estado sólido. Las estructuras de los complejos de cobre (II) (1) y (3) provienen de sus estructuras cristalinas resueltas, mientras que las de los complejos de zinc (II) (2) y (4) se postulan.

Estructuralmente, este conjunto de cuatro complejos tiene sus átomos metálicos centrales que poseen estructuras diversas, a saber. bipirámide trigonal, octaédrica y pirámide cuadrada. Además, los complejos de metal (II) (2) y (4) también muestran distintas diferencias estructurales, el primero es mononuclear mientras que el segundo es dinuclear, lo que podría afectar sus propiedades químicas y biológicas. Por ejemplo, se informó que el complejo de cadena polimérica [Cu(H2ct)Cl]n (ct, tiosemicarbazona del ácido 5α-cetoglutárico) aumenta la síntesis de ADN de las células cancerosas, mientras que el dimérico [Cu(H2ct)Cl]2 disminuyó la síntesis de ADN [39 ]. En otro informe sobre un conjunto de complejos de zinc monoméricos y diméricos de bencilditiocarbamato N-furfuril-N-sustituido, se encontró que las especies monoméricas son más estables que las diméricas y su efecto antiproliferativo es claramente diferente [40].

Todos los complejos eran muy solubles en DMSO pero menos solubles en agua, y las soluciones DMSO-agua (bajas en DMSO) de estos complejos eran adecuadas para diversos estudios físicos, químicos y biológicos. Se utilizaron mediciones de conductividad y espectroscopía UV-visible para dilucidar sus especies metálicas en soluciones acuosas y su estabilidad. La absorbancia en λmax de los espectros UV (30 µM) y los espectros visibles (5 mM), y la conductividad (1 mM) de la solución acuosa de los complejos de metal (II) (1)-(4) y sus precursores se obtuvieron a 0 , 24, 48 y 72 h.

Las sales de nitrato de cobre (II) y zinc (II), y los complejos de metal (II) (1) y (2) tienen valores de conductividad molar de aproximadamente 215–271 S cm2 mol-1 (archivo adicional 1: Tabla S3). que están dentro del rango de electrolitos típicos 2:1 [41, 42]. Esto sugiere que cada molécula de los complejos metal(II)-bis(phen) (1) y (2) se ha disociado en [Cu(phen)2]2+ catiónico y [Zn(phen)2]2+ respectivamente (o existen como sus especies hidratadas [Cu(phen)2(H2O)]2+ y [Zn(phen)2(H2O)2]2+) y dos iones NO3− tras su disolución en solución acuosa. La presencia de estas especies catiónicas acuosas de (1) y (2) está respaldada por intensos picos espectrales de UV {222, 271 nm para (1); 223, 270 nm para (2)} (archivo adicional 1: Tabla S4) atribuido al fenómeno coordinado [43]. El pico espectral visible (λmax, 709 nm; ε, 64 mol−1dm3cm−1) de [Cu(phen)2(H2O)]2+ de (1), debido a la transición dd, es característico de [CuL2]2+ (L = bpy, phen) especies encontradas por otros [44,45,46]. La presencia de dos phen coordinados en las especies hidratadas postuladas de (1) y (2) está respaldada por datos ESI-MS que identifican el aducto gaseoso [M(phen)2(NO3)]+ como la especie principal (archivo adicional 1 : Tabla S5). Las moléculas de agua coordinadas de especies acuosas de (1) y (2) pueden disociarse fácilmente en condiciones de ESI-MS y se sabe que el anión nitrato gaseoso libre se asocia o atrae fácilmente a un catión metálico gaseoso libre o a especies catiónicas de ligando metálico en ESI-MS. condiciones [47, 48]. De hecho, los datos de ESI-MS en modo de iones negativos muestran la presencia de un pico principal de m/z correspondiente a los iones NO3-, lo que indica la presencia de estos aniones disociados (datos no mostrados). La conductividad molar y la absortividad molar visible de (1), y la conductividad molar de (2) permanecen prácticamente sin cambios durante 24, 48 y 72 h, lo que sugiere la estabilidad de las especies catiónicas del metal (II) y ningún cambio en sus esferas de coordinación. .

Además, los complejos dimetal(II) (3) y (4) tienen valores de conductividad molar más altos, de 350 a 366 S cm2 mol-1, que son intermedios entre los valores de 2:1 (145-273 S cm2 mol-1). y electrolitos 3:1 (408–435 S cm2 mol-1) (archivo adicional 1: Tabla S3) [42]. Esto sugiere dos especies de dicobre(II) en la solución de (3). De manera similar, la presencia de 4,4'-bipy coordinado en (3) y (4) se puede inferir comparando el intenso pico de UV a 240 nm de 4,4-bipy libre (ε, 15,333 mol−1dm3cm−1) con el pico UV mejorado de (3) a 230 nm (ε, 65.000 mol-1dm3cm-1) y el de (4) a 231 nm (ε, 78.333 mol-1dm3cm-1), respectivamente, atribuidos a la coordinación 4,4 ′-bipy (archivo adicional 1: Tabla S4). De manera similar a los complejos mononucleares (1) y (2), la presencia de fen coordinado en los complejos de metal dinuclear (II) (3) y (4) se puede inferir de sus intensos picos de UV a 230 nm y 272 nm para (3) y aquellos a 231 nm y 270 nm para (4). Los datos de ESI-MS (archivo adicional 1: Tabla S5) de (3) muestran dos picos en valores de m/z de 237,93 (100%) y 382,18 (31%) que pueden asignarse a los aductos [Cu(phen)- 4,4′-bipy-Cu(phen)(NO3)]3+ y [Cu(phen)(NO3)-4,4′-bipy-Cu(phen)(NO3)]2+, respectivamente. El valor calculado para el pico del 31% es 383,23 que podría ser [Cu(phen)(NO3)-4,4'-bipy-Cu(phen)(NO3) + H]2+. Como se indicó en el párrafo anterior, los dos complejos de metal dinuclear (II), a saber. dimérico [Cu(phen)(NO3)(H2O)-4,4′-bipy-Cu(phen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (3), y dimérico [Zn(phen)(NO3)( H2O)-4,4′-bipy-Zn(phen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (4), tienen iones nitrato coordinados en cada metal (II). Por lo tanto, los iones de nitrato coordinados en las especies catiónicas dimetal(II) en la solución acuosa de DMSO (9:1 v/v) sólo se disocian parcialmente y, por lo tanto, pueden explicar sus inusuales conductividades molares que son intermedias entre 2:1 y 3: 1 electrolitos.

La potencia de citotoxicidad hacia las células huésped no parasitadas (los glóbulos rojos) también es crucial, ya que se usa comúnmente para determinar la seguridad de un fármaco. La salud de los glóbulos rojos es fundamental, ya que son los transportadores de oxígeno desde los pulmones hasta los tejidos del cuerpo, que son importantes para la supervivencia del ser humano [49]. El porcentaje de hemólisis, también conocido como índice hemolítico (HI), se evaluó espectroscópicamente a partir del volumen de hemoglobina liberada. La curva dosis-respuesta de (1)-(4) y sus precursores se muestran en la Fig. 3.

El porcentaje de hemólisis de (1) – (4) y sus precursores después de 72 h de incubación.

Los complejos de cobre (II) (1) y (3), así como el Cu (NO3) 2, mostraron hemólisis dependiente de la concentración con una elevación de la lisis de los glóbulos rojos al aumentar la concentración. A una concentración de ≤ 0,2 µM, los complejos de cobre (II) no poseían ningún efecto tóxico hacia los glóbulos rojos. A 1 µM, no se observó hemólisis o fue leve, donde (3) mostró el valor HI más alto (35%), seguido por el valor HI de (1) y Cu(NO3)2 al 4-3%, respectivamente, lo que indica que no hay hemólisis. . La hemólisis de (1) y (3) alcanza el máximo a 5 µM (80% y 96%), que está cerca del 50% de inhibición del crecimiento del parásito. Se observó un evento inusual en (1) y (3) donde los valores de HI cayeron de 5 µM a 25 µM a 43–36%, respectivamente. Esto puede deberse a la rápida inhibición inducida por ROS iniciada por (1) y (3) en altas concentraciones que llevaron a la oxidación del ion hierro (II) (Fe2+, rojo anaranjado) en la hemoglobina en ion hierro (IV) ( Fe4+, violeta pálido) [50]. Así, el enrojecimiento de la hemoglobina se deterioró y no se pudo medir con precisión a 570 nm. En cuanto a los ligandos y los complejos de zinc (II) (2) y (4), no se observó hemólisis en sangre B+, lo que indica la naturaleza no tóxica hasta 25 µM. Esto implica que estos compuestos son prácticamente seguros para su uso en humanos.

El ensayo basado en SYBR Green 1 se utiliza comúnmente para evaluar posibles fármacos antipalúdicos [21]. Las células rojas maduras no tienen núcleos que contengan ADN y el SYBR Green es un tinte de cianina que fluorescente muy intensamente cuando se une directamente al ADN bicatenario de P. falciparum que infecta las células rojas maduras. Como puede verse en los valores de IC50 (Tabla 1), se encontró que la cepa Pf3D7 era sensible a la cloroquina (CQ) y la artemisinina (ART), pero la cepa Pf5202 era resistente a ellas (IC50> 100 μM). El ligando fen tiene un valor de IC50 de 4,27 μM hacia Pf3D7, lo que demuestra que es un ligando bioactivo mientras que el 4,4′-bipy no lo es. En todos los complejos de metal (II), la quelación del metal (II) por fen provoca principalmente una ligera mejora de su propiedad antipalúdica, excepto (3), donde hay una mejora de aproximadamente 5 veces. El nitrato de cobre (II) fue moderadamente activo contra las cepas de malaria Pf3D7 (IC50, ~ 46 μM) y Pf5202 (IC50, ~ 49 μM) resistentes a los medicamentos, mientras que el nitrato de zinc (II) no fue activo contra ambas cepas. Como se esperaba, los complejos de cobre (II) (1) y (3) son más citotóxicos para la cepa Pf3D7 sensible a los fármacos que los correspondientes análogos de zinc (II) (2) y (4). Esto podría entenderse fácilmente a partir de la característica establecida de los complejos de cobre (II) que tienen la capacidad de inducir estrés por ROS, inhibir el crecimiento e iniciar la muerte celular [51, 52]. Sin embargo, como se verá más adelante, los complejos de zinc (II) mencionados anteriormente no causan ninguna hemólisis de los glóbulos rojos en altas concentraciones, pero son igualmente efectivos contra la cepa de malaria Pf3D7, sensible a los medicamentos.

El complejo mononuclear de cobre (II) [Cu(fen)2(H2O)](NO3)2 (1) era ligeramente más potente que el fen frente a Pf3D7, pero su potencia frente a la cepa de malaria Pf5202 resistente a los medicamentos se redujo tres veces, es decir, frente a sólo ligeramente resistente a los medicamentos. El complejo dicopper(II) (3), con un valor de IC50 de 0,9 μM, era mucho más potente que el phen (IC50 4,27 μM) frente a Pf3D7 (por 4,7x) y seguía siendo eficaz contra Pf5202 (IC50, 2,2 μM), lo que sugiere su uso potencial contra la malaria resistente a los medicamentos. Por otro lado, el complejo de dizinc(II) (4) fue potente contra el Pf3D7 sensible a los medicamentos (IC50, 3,9 μM), pero encontró resistencia total a los medicamentos con la cepa de malaria Pf5202 resistente a la artemisinina (IC50 > 100 μM). Del análisis anterior, parece que (3) es muy prometedor y tiene un buen potencial contra la malaria resistente a los medicamentos cuando vemos que ambos fármacos clínicos, la cloroquina y la artemisinina, experimentaron una caída masiva en la eficacia de más de 3000 × y el Pf5202 fue totalmente resistente a estos dos fármacos. En comparación, otro quimiotipo muy prometedor, un compuesto principal de ciclopentadienilrutenio(II) Ru2 en forma de “medio sándwich”, exhibió una rápida actividad parasiticida contra las etapas de anillo y trofozoito de una cepa Pf3D7 sincronizada y fue muy potente contra la cepa resistente a Pf5202 (IC50, 0,068 μM). ) [7]. Sorprendentemente, el complejo de ligando multidentado Fe (III) más potente fue más potente contra diferentes cepas de malaria resistentes (IC50, 30–50 μM) que contra la cepa Pf3D7 sensible a cloroquina (IC50, 90 μM) [53]. En nuestro caso, el complejo de cobre (II) (3) fue lo contrario, es decir, más potente frente a la cepa sensible Pf3D7 que Pf5202.

Un mecanismo de acción de los agentes antipalúdicos es la inducción de ROS y el consiguiente estrés oxidativo para matar el parásito de la malaria. Para investigar esto, se utilizó un modelo de reacción relevante utilizando PNDA como agente de seguimiento [24,25,26] y un ensayo DCFH-DA intracelular [27].

Ahora está bien establecido que numerosos compuestos antipalúdicos causan la muerte por malaria al inducir ROS y estrés oxidativo [54, 55]. Por tanto, es importante poder cuantificar y comparar la cantidad de ROS generadas, especialmente los radicales hidroxilo más dañinos. Para los complejos metálicos con actividad redox, el ensayo PNDA es el más apropiado ya que el peróxido de hidrógeno en las células humanas y los parásitos de la malaria es omnipresente [56, 57]. La cantidad de radicales ·OH, producidos a partir de la reacción de la cantidad equimolar de los compuestos de prueba con un exceso de H2O2, es directamente proporcional al blanqueo del PNDA (Fig. 4) en una proporción molar de 1:1, y la concentración de ·OH Los radicales producidos se tabulan en la Tabla 2. Los complejos de zinc (II) (2) y (4), así como los materiales de partida, a saber. El fen, el 4,4′-bipy y el nitrato de zinc no generaron radicales ·OH. Todos los compuestos de cobre (II), es decir. Cu(NO3)2, (1) y (3), generaron radicales ·OH que aumentaron de 2 a 4 h y alcanzaron un máximo aproximadamente a las 24 h. En general, los mononucleares (1) generaron una mayor cantidad de radicales ·OH que los dinucleares (3). Se creía que (3) producía menos radicales ·OH que Cu(NO3)2 y (1) debido al impedimento estérico debido a su estructura voluminosa con la fórmula de [Cu(fen)-4,4′-bipy-Cu (fen)]4+ en la solución. El dinuclear (3) podría tener dificultades para formar un intermedio de hidroperóxido de Cu (II) ya que cada ion Cu (II) se consideraba coordinadamente saturado, especialmente si las moléculas de agua lábiles y los iones de nitrato permanecían coordinados. Aunque el complejo mononuclear de cobre (II) (1) es mejor que el complejo dinuclear de cobre (II) (3) para generar radicales ·OH, el primero es menos tóxico para el parásito de la malaria que el segundo, con un valor de CI50 de aproximadamente 4 × más grande. Esto sugiere la participación de otros mecanismos de acción, como han señalado otros [51].

Gráfico del porcentaje de blanqueo con PNDA de mezclas de reacción, que consisten en 42 µM de PNDA, 60 mM de H2O2 y 30 µM de (1)–(4) y sus precursores en tampón de borato a pH 7,5, frente al tiempo en horas.

Las células rojas de la sangre infectadas con malaria se incubaron con una concentración creciente de cada complejo de metal (II), (1) – (4), fen o H2O2 durante 24, 48 y 72 h. Los resultados para las células RBC infectadas con Pf3D7 (Tabla 3 y Fig. 5) muestran que la incubación de 48 h fue la más adecuada ya que el número de veces que aumentó en ROS fue mayor. Al igual que los resultados del ensayo PNDA, se descubrió que el complejo mononuclear de cobre (II) [Cu(phen)2(H2O)](NO3)2 (1) es un mejor generador de ROS intracelular que el dinuclear [Cu(phen)(NO3) (H2O)]-4,4'-bipy-[Cu(fen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (3). Sin embargo, (1) es menos potente que (3) contra la cepa de malaria Pf3D7 (Tabla 1, valores IC50). Por lo tanto, la mayor potencia antipalúdica de (3) no puede originarse únicamente a partir de esta ROS inducida dentro de las células rojas de la sangre, y otros modos de acción están implicados como se mencionó en la sección anterior [51].

Los cambios en las especies reactivas de oxígeno (ROS) inducidos por fen, H2O2 y (1) – (4) en Pf3D7. Azul (24h). Naranja (48 h). Gris (72 h)

En cuanto a las células RBC infectadas con Pf5202 tratadas con una concentración creciente de complejos metálicos, la mejor duración de incubación para el tratamiento de células RBC infectadas con Pf5202 fue todavía de 48 h (Tabla 4 y Fig. 6). Entre los cuatro complejos, los dos complejos de zinc (II), a saber. (2) y (4), parecieron no generar ninguna ROS ya que los aumentos en las ROS fueron negativos. Por otro lado, los dos complejos de cobre (II), a saber. (1) y (3), indujeron un cambio creciente en ROS con una concentración creciente de los complejos. A diferencia de los resultados para Pf3D7, el complejo dicopper(II) (3) fue un mejor generador de ROS intracelular que (1) en la cepa de malaria Pf5202 resistente a los medicamentos y esto podría correlacionarse con su alta potencia hacia la cepa Pf5202. Esto sugiere que los complejos de dicobre (II) tienen más potencial para superar las cepas de malaria resistentes a los medicamentos. Se ha planificado una investigación más detallada sobre el mecanismo del modo de acción inducido por ROS de (3), y puede implicar atacar y dañar las proteínas relacionadas con redox y, por lo tanto, alterar la homeostasis y los procesos redox como se encontró para las proteínas generadoras de radicales alquilo. medicamentos contra la malaria con peróxido, como la artemisinina [58]. Debido a un hallazgo reciente, (1) y (3), como inductores de ROS, también se probarán para ver si podrían aumentar la potencia de los antipalúdicos que contienen peróxido, como la artemisinina, mediante la oxidación directa de la oxihemoglobina a metahemoglobina y luego a hemicromos que contienen hierro (III) que luego activan el resto de peróxido para generar radicales centrados en carbono para inducir la muerte de la malaria eritrocítica [59]. Estos dos complejos de cobre (II) también pueden ser similares a las metaloporfirinas, que recientemente se descubrió que mejoran la propiedad antipalúdica de la artemisinina y los fármacos antipalúdicos endoperóxido sintéticos [60]. Además del estrés oxidativo como modo de acción en esta sección, en las dos secciones siguientes se presenta la inhibición del proteosoma y la acción dirigida a las mitocondrias de la malaria.

Los cambios en las especies reactivas de oxígeno (ROS) inducidos por fen, H2O2 y (1) – (4) en Pf5202. Azul (24 h). Naranja (48 h). Gris (72 h)

Existe una creciente preocupación por la aparición y propagación de cepas de malaria resistentes a los medicamentos, y se están desarrollando muchos enfoques para superar la resistencia a los medicamentos. De hecho, están surgiendo más resultados que muestran el potencial de desarrollar potentes fármacos específicos para parásitos dirigidos al proteosoma de la malaria basándose en las claras diferencias entre el parásito de la malaria y el huésped humano [61]. Recientemente, se descubrió que un tripéptido vinilsulfona, que inhibía selectivamente el sitio TL del proteosoma 20S de P. falciparum, podía atenuar el crecimiento del parásito in vivo sin dañar apreciablemente al huésped [62]. La razón para no dañar al huésped se atribuyó a una inhibición deficiente del sitio CT-L del proteosoma 20S humano. En otro informe, un inhibidor del proteasoma, lactacistina, inhibió el desarrollo de las etapas exoeritrocítica y eritrocítica del parásito de la malaria [63]. Como tal, esta sección examina la inhibición de los tres sitios proteolíticos del proteosoma 20S de los lisados ​​Pf3D7 y Pf5202 en comparación con un inhibidor selectivo del sitio TL conocido (VR23), y los resultados se muestran en la Tabla 5 y la Fig. 7.

IC50 de fen y (1) – (4) en el proteosoma 20S en el sitio similar a tripsina (TL) después de incubar con el sustrato respectivo en una incubadora de CO2 durante 30 minutos. *significa > 25 µM

Como se esperaba, VR23 inhibió selectivamente el sitio proteolítico TL en las cepas de malaria Pf3D7 y Pf5202. Curiosamente, los valores IC50 de VR23 para ambas cepas de malaria son prácticamente los mismos. El ligando de fen libre también inhibió selectivamente la TL de ambas cepas del parásito. Curiosamente, el fen es casi 2,5 veces mejor en la inhibición del sitio TL de la cepa Pf5202 resistente a los medicamentos que el de Pf3D7. Los dos complejos de zinc (II), (2) y (4), inhibieron mal los tres sitios proteolíticos del proteosoma. Sin embargo, los dos complejos de cobre (II), (1) y (3), inhibieron el sitio TL de Pf3D7 de manera más selectiva que los otros dos sitios (es decir, CL y CL), y ambos tenían valores de IC50 similares de aproximadamente 2,5 μM. Aunque estos complejos se comportan de la misma manera con la cepa Pf5202 resistente a los medicamentos, sus valores de IC50 se volvieron aproximadamente 1,5 veces más bajos, lo que demuestra que son mejores para inhibir el sitio TL de esta cepa que el de la cepa Pf3D7 sensible a los medicamentos. Esto es ventajoso ya que el parásito de la malaria puede resultar dañado por dicha inhibición selectiva del sitio TL y potencialmente puede superar la resistencia a los medicamentos en la malaria. Al comparar los resultados del ensayo antipalúdico in vitro para Pf5202, (3) (IC50, 2,2 μM) es más potente que el de (1) (IC50, 17,8 μM). Esto sugiere que la propiedad antipalúdica de los complejos de cobre (II) hacia Pf5202 no depende en gran medida de la inhibición selectiva del sitio TL. Otra observación desconcertante es que los complejos (1), (3) y fen muestran un aumento significativo en la eficiencia para inhibir el sitio TL de Pf5202 en comparación con el de Pf3D7 (por un factor de 1,5x-2,5x), pero encuentran diferentes grados de acción del fármaco. -resistencia en Pf5202 (al tener valores de CI50 del ensayo antipalúdico más altos para Pf5202 que los de Pf3D7 (por un factor de 3-20x). La sensibilidad adicional de la cepa Pf5202 resistente a los medicamentos hacia (1), (3) y fen, en comparación a Pf3D7 sensible a los medicamentos, es el primer ejemplo de metalfármacos contra la malaria conocidos. Se desconoce la sensibilidad adicional del Pf5202 resistente a los medicamentos hacia el inhibidor selectivo de TL, pero su origen puede ser similar a una cepa mutante de malaria que era resistente a un inhibidor selectivo de CT. inhibidor y tenía una mutación puntual en la subunidad no catalítica del proteasoma β6.64 Este estudio reciente sobre el inhibidor de CT específico de la malaria, asparagina etilendiamina, muestra que la inhibición de CT no es óptima y necesita coinhibición de la actividad de TL (es decir, sitio β5 ) [64].

Uno de los mecanismos de acción de algunos fármacos contra la malaria, como las artemisininas, es la despolarización de la membrana mitocondrial, que luego desencadena la apoptosis del parásito [65,66,67]. Se utilizó el ensayo de potencial de membrana JC-1 para evaluar el potencial de membrana mitocondrial (Δψm) de Pf3D7 y Pf5202 tratados con diferentes concentraciones (1, 5, 25 μM) de complejos de cobre (II) (1) y (3) durante 12 h y 48 h [68] y los resultados se muestran en la Tabla 6. El parásito de la malaria sano no tratado tiene un Δψm alto. En general, ambos complejos de cobre (II) causaron una disminución en el potencial de membrana mitocondrial en ambas cepas de malaria con una concentración creciente de complejos para ambos períodos de incubación. A 1 μM, tanto (1) como (3) indujeron una caída significativa en Δψm para las cepas Pf3D7 y Pf5202, lo que sugiere el colapso de la membrana mitocondrial. Por lo tanto, la despolarización del potencial de membrana mitocondrial de la malaria es un mecanismo de acción que contribuye a ambos complejos de cobre (II) y se acepta comúnmente como parte del evento que conduce a la muerte de la malaria de tipo apoptótico.

El programa definitivo de muerte celular en P. falciparum inducido por fármacos antipalúdicos, a diferencia del de las células humanas, aún no es concluyente [69]. También se sabe que Plasmodium falciparum en glóbulos rojos tratados con fármacos como la cloroquina produce una muerte similar a la autofagia sin condensación de cromatina (apoptosis) o hinchazón y alteración de la membrana plasmática (necrosis) [70]. Aunque P. falciparum carece de caspasas clásicas, se ha informado que puede producir metacaspasas que provocan la inducción de la muerte celular programada [71]. En este caso, para realizar una investigación preliminar sobre el tipo de muerte celular de las cepas de P. falciparum tratadas con complejos de cobre (II) (1) y (3), se utilizaron tinciones de Giemsa y Hoechst para examinar los cambios morfológicos de las células parásitas tratadas en los glóbulos rojos infectados.

El tinte Giemsa, una mezcla de azur, azul de metileno y eosina, es un tinte de ácido nucleico de uso común que discrimina los glóbulos rojos humanos y los parásitos de la malaria [72]. Teñirá los glóbulos rojos humanos, el citoplasma de la malaria y el núcleo de la malaria (cromatina) de color gris rosado, azul violáceo y rojo violáceo, respectivamente. Las células RBC infectadas con Pf3D7 y Pf5202 se trataron con concentraciones crecientes (0,2, 1, 5 y 25 µM) de complejos de cobre (II) (1) y (3) durante un período de 72 h. Se capturaron imágenes de eritrocitos no parasitados (nRBC) no tratados y parasitados (pRBC), así como de eritrocitos infectados tratados, utilizando un microscopio vertical de campo brillante con inmersión en aceite y un aumento de 100 ×. Los resultados se presentan en la Fig. 8.

Examen de morfología de Pf3D7 y Pf5202 en un frotis teñido con Giemsa después de tratarlo con una concentración creciente de (1) y (3) durante 72 h con un aumento de 100x (inmersión en aceite). Flecha azul: rotura de esquizontes; flecha verde: forma picnótica distorsionada y encogida; flecha naranja: hemólisis

Los nRBC no tratados se tiñeron de color gris rosado y no se observó P. falciparum. Los nRBC no tratados parecían ser células sanas y redondeadas. Se observó una observación similar para los pRBC no tratados, donde todos los pRBC no tratados permanecieron como células sanas y redondeadas, y la morfología de Pf3D7 y Pf5202 estaba en buenas condiciones y tenía una parasitemia mucho mayor. La mayoría (~ 90%) de los Pf3D7 y Pf5202 no tratados estaban en las formas de trofozoíto y esquizonte, que consisten en anillos con pequeños puntos de cromatina doble en forma de “auriculares”. Después del tratamiento con (1) o (3) contra pRBC, se observaron varias observaciones morfológicas. Las anomalías comunes de los glóbulos rojos incluyen hemólisis, deformación de la membrana y disminución de la densidad de los glóbulos rojos. En cuanto a la morfología de Pf3D7 y Pf5202, se observó disminución de la parasitemia, deformación de la membrana parasitaria, contracción del parásito, ruptura del esquizonte y formación de una forma picnótica (no viable). Todas estas anomalías son características de la muerte celular programada por apoptosis de los glóbulos rojos y P. falciparum [73]. Numerosos investigadores informaron observaciones similares cuando P. falciparum fue tratado con cloroquina, atovacuona, péptido de fluorescencia sintético, oligómero de péptido-morfolino, compuestos de endoperóxido, complejos de Zn(II)-dipicolilamina o dihidroartemisinina [74,75,76,77,78, 79].

Cuando los glóbulos rojos infectados con Pf3D7 se trataron con (1) (IC50 = 3,51 µM), los pRBC permanecieron en condiciones saludables a 0,2 µM y 1 µM y P. falciparum apareció principalmente como trofozoítos y esquizontes. Entre 1 µM y 25 µM, los pRBC comenzaron a deformarse y romperse, lo que provocó hemólisis. A su vez, la lisis de los glóbulos rojos redujo indirectamente la parasitemia de Pf3D7 debido a la falta de nutrientes suministrados. En este punto, Pf3D7 sufrió picnosis y la membrana de los parásitos se distorsionó, encogió y rompió como se muestra en las imágenes de pRBC tratados con 5 µM y 25 µM. Se observaron observaciones similares cuando los glóbulos rojos infectados con Pf5202 se trataron con (1) (IC50 = 17,87 µM). A 0,2 µM y 1 µM, Pf5202 apareció como esquizontes sanos. Cuando las células pRBC se trataron con concentraciones superiores a 1 µM, se observó deformación de la membrana de pRBC, hemólisis, disminución de la parasitemia, formación de parásitos picnóticos, reducción de tamaño y ruptura de esquizontes.

Las características morfológicas de la apoptosis de P. falciparum pueden estar indicadas por la condensación cromosómica y la fragmentación de los núcleos de P. falciparum en las células eritrocíticas no nucleares [73, 80]. Los cromosomas condensados ​​se teñirían de azul brillante. Las células pRBC se trataron con (1) y (3) respectivamente durante 72 h, y los pRBC resultantes se visualizaron y fotografiaron con un aumento de 100 × con inmersión en aceite. Las imágenes típicas se ampliaron para observar células individuales y se representan en la Fig. 9 para Pf3D7 y en la Fig. 10 para Pf5202. A las 72 h de incubación, P. falciparum se encontraba en la etapa de trofozoíto maduro. Los núcleos de los trofozoitos de P. falciparum en pRBC se observaron bajo un microscopio de campo claro como puntos, y se tiñeron de un azul más brillante que aumentó en intensidad de fluorescencia al aumentar la concentración de complejos de cobre (II) de (1) y (3) de 0,2, 1, 5 a 25 µM en comparación con los pRBC no tratados. Dado que la tinción de Hoechst es específica del estado de la cromatina y la conformación del ADN, la intensidad de fluorescencia cada vez más fuerte observada sugiere una mayor deformación y condensación de la cromatina y el ADN [81].

Observación morfológica nuclear de Pf3D7 utilizando tinción de Hoechst después de tratarlo con una concentración creciente de (1) y (3) durante 72 h con un aumento de 100x (inmersión en aceite)

Observación morfológica nuclear de Pf5202 utilizando tinción de Hoechst después de tratarlo con una concentración creciente de (1) y (3) durante 72 h con un aumento de 100x (inmersión en aceite)

Cuando se trataron células eritrocitos infectadas con Pf3D7 con (1) y (3), se observó una fluorescencia más brillante en el tratamiento con 1 µM o más del complejo de dicobre (3) que en el tratamiento con (1). Esto sugiere que este complejo de cobre (3) (CI50, 0,90 µM) indujo una condensación de cromatina más fuerte que (1). La aparición de condensación de cromatina indica directamente la inducción de un fenómeno similar a la apoptosis. Por lo tanto, Pf3D7 sufrió apoptosis cuando se trató con (1) y (3). Además, se observaron parásitos distorsionados, formas picnóticas y ruptura de esquizontes a 5 µM y 25 µM para (1) y a partir de 1 µM para (3). Se observaron fenómenos similares cuando se trató Pf5202 con (1) y (3). El complejo de dicobre (3) (CI50, 2,21 µM) tenía una intensidad de fluorescencia más fuerte a partir de 5 µM que el complejo de cobre mononuclear (1). Esta mayor fluorescencia podría explicarse por el hecho de que (3) es cada uno de ellos un complejo dinuclear de cobre (II) que consta de dos iones de cobre (II), y era posible que se produjera una generación doble o más rápida de ROS, lo que daría como resultado más P. falciparum con mayor condensación de cromatina. Además de eso, se observaron parásitos distorsionados, formas picnóticas y roturas de esquizontes a 5 µM y 25 µM. En general, los resultados sugieren que los complejos de cobre (II) probados podrían inducir la apoptosis de P. falciparum.

Los complejos de cobre (II) mostraron potencia antipalúdica contra Pf3D7 y Pf5202 en un rango submicromolar a micromolar. Los complejos de zinc (II) fueron eficaces contra Pf3D7 con un índice terapéutico excelente, pero encontraron una resistencia total contra Pf5202. Entre los cuatro, el complejo dinuclear de cobre (II) fue el más potente contra ambas cepas. Los complejos de zinc (II) no causaron hemólisis de los glóbulos rojos, mientras que los complejos de cobre (II) indujeron una mayor hemólisis al aumentar la concentración. Otros estudios mecanicistas de ambos complejos de cobre (II) en las cepas Pf3D7 y Pf5202 mostraron inducción de ROS, inhibición del proteasoma de la malaria 20S, pérdida del potencial de membrana mitocondrial y características morfológicas indicativas de apoptosis. El dinuclear [Cu(phen)-4,4′-bipy-Cu(phen)](NO3)4 es muy potente y puede superar la resistencia total al fármaco de Pf5202 hacia la cloroquina y la artemisinina. Los otros tres complejos de cobre (II) y zinc (II) solo fueron efectivos contra el Pf3D7 sensible a los fármacos, y este último no provocó hemólisis de los glóbulos rojos.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles previa solicitud del autor correspondiente.

Potencial de membrana mitocondrial

4,4′-bipiridina

Terapias combinadas con artemisinina

artemisinina

Sal de difosfato de cloroquina

Nitrato de cobre (II) trihidrato

Concentración inhibidora al 50% de inhibición del crecimiento.

Glóbulos rojos no parasitados

Plasmodium falciparum 3D7

Plasmodium falciparum IPC5202

1,10-fenantrolina

Glóbulos rojos parasitados

Instituto Conmemorativo del Parque Roswell

Especies de oxígeno reactivas

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Esta investigación fue financiada por (i) Universiti Malaya Frontier Research Grant (FRG), número de subvención: FG036-15AFR; (ii) Beca de investigación de la Universidad Médica Internacional, número de subvención: BMS I/2019(17) y (iii) Programa de becas de investigación fundamental (FRGS), número de subvención FRGS/1/2019/SKK12/IMU/03/1.

Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universiti Malaya, 50603, Kuala Lumpur, Malasia

Jing Wei Lai, Mohd Jamil Maah, Kong Wai Tan y Rozie Sarip

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Rakesh Ganguly

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Médica Internacional, 57000, Kuala Lumpur, Malasia

Pueblo de Loke Tim

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Chew Hee Ng

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JWL realizó todos los experimentos (excepto los de estructura cristalina de rayos X y ESI-MS) y análisis. MJM, RS (también ayudaron en el análisis de RMN) y YALL proporcionaron supervisión y revisión del manuscrito. RG y KWT realizaron y resolvieron la estructura cristalina de rayos X de (3). LTK guió en los cultivos de parásitos y como donante de sangre B+. CHN participó en el diseño experimental, redacción de manuscritos, supervisión y revisión. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Correspondencia a Chew Hee Ng.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Datos cristalográficos del complejo de cobre (II) (3). Tabla S2. Distancias de enlace seleccionadas y ángulos de enlace para el complejo de cobre (II) (3).

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Lai, JW, Maah, MJ, Tan, KW et al. Complejos de polipiridilo de metal (II) dinucleares y mononucleares contra Plasmodium falciparum sensible y resistente a los medicamentos y su modo de acción. MalarJ 21, 386 (2022). https://doi.org/10.1186/s12936-022-04406-0

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Recibido: 15 de julio de 2022

Aceptado: 28 de noviembre de 2022

Publicado: 17 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-022-04406-0

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