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Jun 01, 2023

TDP

Nature (2023)Cita este artículo 3754 Accesos 55 Detalles de Altmetric Metrics El ensamblaje anormal de la proteína 43 de unión al ADN TAR (TDP-43) en células neuronales y gliales caracteriza casi todos los casos de

Naturaleza (2023)Cita este artículo

3754 Accesos

55 altmétrico

Detalles de métricas

El ensamblaje anormal de la proteína 43 de unión al ADN TAR (TDP-43) en células neuronales y gliales caracteriza casi todos los casos de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y alrededor de la mitad de los casos de degeneración del lóbulo frontotemporal (DLFT)1,2. Un papel causal del ensamblaje de TDP-43 en la neurodegeneración se evidencia por mutaciones sin sentido hereditarias dominantes en TARDBP, el gen que codifica TDP-43, que promueve el ensamblaje y da lugar a ELA y FTLD3,4,5,6,7. Al menos cuatro tipos (A-D) de FTLD con patología TDP-43 (FTLD-TDP) se definen por distribuciones cerebrales distintas de TDP-43 ensamblado y se asocian con diferentes presentaciones clínicas de demencia frontotemporal8. Anteriormente demostramos, mediante microscopía crioelectrónica, que el TDP-43 se ensambla en filamentos de amiloide en la ELA y el FTLD-TDP9 tipo B. Sin embargo, las estructuras del TDP-43 ensamblado en FTLD sin ALS seguían siendo desconocidas. Aquí informamos las estructuras de microscopía crioelectrónica de TDP-43 ensamblado a partir de los cerebros de tres individuos con el tipo más común de FTLD-TDP, el tipo A. TDP-43 formó filamentos amiloides con un nuevo pliegue que era el mismo en todos los individuos. lo que indica que este pliegue puede caracterizar el tipo A FTLD-TDP. El pliegue se asemeja a una insignia de galón y es diferente al pliegue en forma de doble espiral de la ELA y el FTLD-TDP tipo B, lo que establece que los distintos pliegues de filamentos del TDP-43 caracterizan diferentes condiciones neurodegenerativas. Las estructuras, en combinación con espectrometría de masas, llevaron a la identificación de dos nuevas modificaciones postraduccionales del TDP-43 ensamblado, la citrulinación y la monometilación de R293, e indican que pueden facilitar la formación de filamentos y la variación estructural observada en filamentos individuales. Las estructuras de los filamentos de TDP-43 del FTLD-TDP tipo A guiarán los estudios mecanicistas del ensamblaje de TDP-43, así como el desarrollo de compuestos diagnósticos y terapéuticos para las proteinopatías de TDP-43.

La proteína 43 de unión a ADN TAR (TDP-43) es una proteína de unión a ARN expresada de forma ubicua con diversas funciones en el procesamiento de ARN. Reside principalmente en los gránulos de ribonucleoproteína nucleares, pero también sufre transporte nucleocitoplasmático para participar en los gránulos de ribonucleoproteína citoplasmáticos10. La parte amino terminal de TDP-43 incluye un dominio DIX (desaliñado y axina), una señal de localización nuclear y motivos de reconocimiento de ARN (RRM) en tándem. La parte carboxi-terminal comprende un dominio de baja complejidad (LCD) intrínsecamente desordenado, que contiene regiones enriquecidas en glicina, residuos hidrófobos y glutamina y asparagina (Q/N). El dominio DIX, los RRM y el LCD contribuyen a la asociación de TDP-43 con gránulos de ribonucleoproteína y ARN10,11.

En la enfermedad, el TDP-43 de longitud completa y los fragmentos C-terminales (CTF) anormalmente truncados se ensamblan y se ubiquitilan y fosforilan1,2. Los conjuntos tienen morfologías granulofilamentosas, con diámetros de 10 a 15 nm (refs. 9,12,13,14,15,16,17,18,19). Se unen mal al colorante amiloidofílico tioflavina-S20. Las estructuras de microscopía crioelectrónica (crio-EM) de TDP-43 ensamblado de las cortezas prefrontal y motora de dos individuos con esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y degeneración del lóbulo frontotemporal tipo B con patología TDP-43 (FTLD-TDP) han mostrado amiloide. filamentos con un pliegue idéntico en forma de doble espiral (pliegue de doble espiral)9. El núcleo ordenado de estos filamentos está formado por la mitad N-terminal de la pantalla LCD (G282-Q360), y las regiones flanqueantes forman una capa difusa.

Se desconocían las estructuras del TDP-43 ensamblado en otras enfermedades neurodegenerativas. Un estudio crio-EM reciente en el que participaron cuatro personas con FTLD-TDP tipos A–D en ausencia de ELA no encontró filamentos amiloides de TDP-43 e informó que, en cambio, los filamentos de la proteína transmembrana 106B (TMEM106B) caracterizan FTLD-TDP21. Sin embargo, otros estudios han demostrado que los filamentos de TMEM106B se acumulan en el cerebro humano de manera dependiente de la edad en muchas afecciones neurodegenerativas, incluidas tauopatías y sinucleinopatías, así como en individuos neurológicamente normales22,23,24,25.

Aquí, utilizamos crio-EM para determinar las estructuras de TDP-43 ensamblado en los cerebros de individuos con el tipo más común de FTLD-TDP, el tipo A. Mostramos que TDP-43 de hecho forma filamentos de amiloide, que están presentes además de filamentos TMEM106B. Las estructuras revelan que, a diferencia de TMEM106B, TDP-43 forma distintos pliegues de filamentos de amiloide en diferentes condiciones neurodegenerativas y detallan su base estructural.

Extrajimos TDP-43 ensamblado de la corteza prefrontal de individuos con FTLD-TDP tipo A (Tabla de datos extendidos 1), utilizando el método que desarrollamos para ELA con FTLD-TDP9 tipo B. Cuatro individuos portaban mutaciones en GRN asociadas con FTLD-TDP tipo A8,26,27, mientras que un individuo tenía GRN de tipo salvaje. Todos los individuos tenían abundantes inclusiones citoplasmáticas neuronales compactas, neuritas distróficas cortas e inclusiones intranucleares neuronales poco frecuentes de TDP-43 ensamblado concentrado en la segunda y tercera capas corticales, indicativo de FTLD-TDP8 tipo A (Datos ampliados, Fig. 1a, b). La inmunotransferencia de los extractos mostró que los ensamblajes estaban compuestos por TDP-43 y CTF de longitud completa y estaban fosforilados en S409 y S410, como se observó anteriormente1,2 (Datos ampliados, figura 1c).

Utilizamos crio-EM para obtener imágenes de los extractos de la corteza prefrontal de dos de los individuos con mutaciones de GRN y del individuo con GRN de tipo salvaje (Datos ampliados, figura 1d). Esto reveló una población de filamentos rectos no ramificados con superficies granulares y anchos proyectados de aproximadamente 10 a 15 nm, lo que coincide con informes previos de filamentos de TDP-43 in situ en los cerebros de individuos con FTLD-TDP13,15, así como en el cerebro. extractos9,17,18,19. La identidad TDP-43 de los filamentos se confirmó mediante microscopía electrónica con tinción negativa con inmunooro (Datos ampliados, figura 1e).

Determinamos las estructuras de los núcleos ordenados de los filamentos TDP-43 para cada uno de los tres individuos de forma independiente mediante la reconstrucción helicoidal de las imágenes crio-EM, con resoluciones de hasta 2,4 Å (Fig. 1a, Datos ampliados, Fig. 2a-c). y tabla de datos ampliada 2). Los filamentos comprendían un único protofilamento de amiloide de moléculas de TDP-43 apiladas. Las reconstrucciones revelaron un nuevo pliegue del filamento TDP-43 que era idéntico entre los individuos, independientemente de la variación genética en GRN. Nuestros resultados indican que este pliegue del filamento de amiloide TDP-43 puede caracterizar el FTLD-TDP tipo A.

a, mapas Cryo-EM de filamentos TDP-43 de la corteza prefrontal de tres individuos con FTLD-TDP tipo A, mostrados como cortes centrales perpendiculares al eje helicoidal. GRN indica individuos con mutaciones en GRN asociadas con FTLD-TDP tipo A. Barras de escala, 25 Å. b, Esquema de la organización del dominio de TDP-43. Se muestran los sitios de fosforilación asociados a enfermedades. La línea negra indica la región que forma el pliegue ordenado de los filamentos. NLS, señal de localización nuclear. c, Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de los elementos de la estructura secundaria del pliegue del filamento. Las flechas indican cadenas β. d, mapa Cryo-EM mostrado en niveles de contorno alto (gris) y bajo (amarillo) y modelo atómico, mostrado para una sola molécula de TDP-43 perpendicular al eje helicoidal. Las cinco capas del pliegue del filamento están etiquetadas. Se indican una densidad similar a una proteína menos bien resuelta que se extiende desde R272 (flecha negra), una densidad similar a un péptido aislada adyacente a G351-N355 (flecha amarilla) y densidades no proteicas dentro de las cavidades entre las capas 1 a 3 (flechas rojas). . En c y d, se resaltan las regiones ricas en glicina (G274 – G310, magenta), hidrófobas (M311 – S342, blanco) y ricas en Q/N (Q343 – Q360, verde).

También se observaron filamentos TMEM106B simples y dobles en las imágenes crio-EM para cada individuo, en función de sus anchos proyectados característicos de 12 y 26 nm, respectivamente, sus extremos romos y su falta de granularidad superficial (Datos ampliados, Fig. 3a). , como se informó anteriormente en FTLD-TDP21,22,23. La presencia de TMEM106B se confirmó mediante espectrometría de masas, que identificó péptidos mapeados en la región C-terminal que forma el núcleo ordenado de los filamentos21,22,23 (Datos ampliados, figura 3b y tabla complementaria 1).

La presencia de filamentos TDP-43 y filamentos TMEM106B en FTLD-TDP tipo A, así como en ELA con FTLD-TDP tipo B9,22, está en desacuerdo con un informe reciente de que los filamentos de amiloide en FTLD-TDP están compuestos de TMEM106B. pero no TDP-43 (ref. 21). Las diferencias en los protocolos de extracción de cerebros pueden explicar esta discrepancia. Encontramos filamentos de TDP-43 en el sobrenadante después de la centrifugación a 27.000 g, mientras que el otro estudio examinó el sedimento después de la centrifugación a 21.000 g. También se han observado filamentos de TMEM106B en el cerebro de individuos con tauopatías y α-sinucleinopatías, así como en el cerebro de individuos neurológicamente normales22,23,24,25. Las inclusiones de TMEM106B no se colocalizan con inclusiones de TDP-43, tau o α-sinucleína28. A diferencia de estas proteínas, no existen relaciones claras entre los diferentes pliegues del filamento de TMEM106B y las enfermedades. La evidencia disponible es consistente con la acumulación dependiente de la edad de filamentos TMEM106B en el cerebro humano22,28, que pueden ser modificados por el haplotipo TMEM106B29.

Nuestras reconstrucciones crio-EM tuvieron una resolución suficiente para visualizar grupos de péptidos y solventes ordenados, lo que nos permitió construir un modelo atómico preciso del pliegue del filamento TDP-43 y establecer su giro helicoidal hacia la derecha (Fig. 1b-d y Figs. de datos extendidos). 2d,e y 4a,b). El pliegue consta de cinco capas conectadas formadas por R272-Q360 en la pantalla LCD. Las dos primeras capas están formadas por la región rica en glicina (G274-G310), la región hidrofóbica (M311-S342) contribuye con la tercera y cuarta capas, y la región rica en Q/N (Q343-Q360) forma la quinta capa. (Datos ampliados Fig. 4c, d).

El pliegue se centra alrededor de una hebra β retorcida de 11 residuos formada por A321-Q331 en la cuarta capa, que forma cremalleras estéricas con hebras β en las capas tercera y quinta vecinas e imparte una disposición que se asemeja a un galón de tres barras. insignia (Datos ampliados, Fig. 4e). Debido a esta semejanza, en adelante nos referiremos al pliegue como pliegue en forma de galón. La primera y segunda capas contienen sólo hebras β cortas de 2 a 3 residuos que no participan en el embalaje con cremallera. Además de los enlaces de hidrógeno dentro de las láminas β intermoleculares, los filamentos se estabilizan mediante escaleras de enlaces de hidrógeno formadas por cadenas laterales de glutamina y asparagina y mediante interacciones de apilamiento escalonado entre residuos aromáticos. Las capas se asocian a través de enlaces de hidrógeno entre abundantes residuos polares neutros y glicina (Datos ampliados, figura 4f). La segunda y tercera capas también interactúan a través de un grupo de residuos hidrófobos entre A297 y F316 (Datos ampliados, figura 4g). Tres residuos de arginina en el extremo N constituyen los únicos residuos cargados en el pliegue. Dos de ellos, R272 y R275, se encuentran en la primera capa expuesta al disolvente. El tercero, R293, está ubicado en una posición enterrada inusual dentro de un bucle compacto que une la primera y la segunda capa.

La densidad de proteínas menos ordenada se extiende desde el residuo N-terminal R272 y cubre un parche hidrofóbico formado por W334-A341 a su vez que une las capas cuarta y quinta (Fig. 1c, d). Esta densidad podría acomodar aproximadamente 17 residuos (V255 – E271), que incluirían β5 del segundo TDP-43 RRM. Por lo tanto, los residuos N-terminal de V255 y C-terminal de Q360 forman la capa difusa de los filamentos. La presencia de CTF que carecen de todo o parte de V255-E271 en los filamentos puede explicar por qué esta densidad proteica adicional estaba menos ordenada30. Su presencia provocaría la exposición del parche hidrofóbico (W334–A341). Se cree que los parches de superficie hidrofóbica en los filamentos de amiloide participan en interacciones aberrantes31.

Otra densidad similar a un péptido se encuentra en la superficie exterior de la quinta capa, adyacente a G351-N355 (Fig. 1a, d). Su naturaleza desconectada impidió la asignación de secuencia. Puede originarse en las regiones flanqueantes N-terminal o C-terminal o en una proteína que interactúa separada. Anteriormente se ha demostrado que los péptidos desconectados se asocian con filamentos de α-sinucleína32. También observamos densidades no proteicas dentro de las cavidades entre la primera, segunda y tercera capas (Fig. 1d). A diferencia de las densidades de proteínas, parecían parcialmente contiguas a lo largo del eje helicoidal (Datos ampliados, figura 4h), posiblemente porque no siguen la misma simetría helicoidal que el TDP-43. También se han observado densidades no proteicas enterradas en filamentos de tau y α-sinucleína del cerebro humano y pueden representar cofactores para la formación de filamentos33,34.

La clasificación tridimensional (3D) de los segmentos de filamento crio-EM del individuo con el conjunto de datos más grande reveló conformaciones alternativas de la región N-terminal R272-G295 y del giro G335-Q343 que une las capas cuarta y quinta (Fig. 2a –c y datos ampliados Fig. 5a–d). Menos del 5% de los segmentos de filamentos contribuyeron a clases con estas conformaciones alternativas, lo que demuestra que eran poco comunes (Tabla de datos ampliados 2). No se observó variación en las regiones de empaquetamiento con cremallera entre las hebras β. La conformación alternativa de la región N-terminal, pero no del giro que une las capas cuarta y quinta, se observó para el segundo individuo, y no se observaron conformaciones alternativas para el tercer individuo, consistente con los tamaños más pequeños de sus conjuntos de datos (Extended Tabla de datos 2).

a, Superposición de modelos atómicos de filamentos TDP-43 de FTLD-TDP tipo A con diferentes conformaciones locales de la región N-terminal y del giro que conecta la cuarta capa con la quinta (L4-L5). b, c, mapas Cryo-EM y modelos atómicos con diferentes conformaciones locales de la región N-terminal (b) y del giro que conecta la cuarta capa con la quinta (L4-L5) (c), mostrados para un solo TDP -43 molécula perpendicular al eje helicoidal. d, Micrografía de ejemplo que muestra las posiciones de los segmentos de filamentos que contribuyen a los mapas crio-EM con diferentes conformaciones locales, que ocurren en filamentos individuales. Barra de escala, 50 nm. Se muestran más ejemplos en la figura 6 de datos ampliados. En a–d, la conformación principal se muestra en cian, la conformación local alternativa de la región N-terminal en magenta y la conformación local alternativa de la región N-terminal y la Gire conectando la cuarta capa con la quinta en amarillo.

Determinamos las estructuras de los segmentos de filamentos que contienen las conformaciones alternativas, con resoluciones de hasta 2,5 Å (Fig. 2a y Datos ampliados Fig. 5). En la conformación alternativa de la región N-terminal, los residuos G281-G295 siguen aproximadamente el mismo camino que los residuos R272-P280 en la conformación principal, exponiendo R293 en la superficie del filamento, y los residuos R272-P280 están en la capa difusa (Fig. 2b). En la conformación alternativa del giro que une las capas cuarta y quinta, varios residuos cambian sus posiciones interior-exterior, con M336, A341 y Q343 quedando enterrados, mientras que M339 y S342 quedan expuestos en la superficie (Fig. 2c).

El mapeo de las ubicaciones de los segmentos de filamentos en las micrografías reveló que las moléculas de TDP-43 con diferentes variaciones estructurales locales podrían coexistir en filamentos individuales (Fig. 2d y Datos ampliados, Fig. 6). Segmentos de las mismas estructuras variantes agrupados en bloques de longitud variable, sin direccionalidad aparente en su disposición. También se ha observado variación estructural local en las regiones de giro en filamentos individuales de la proteína de cadena ligera amiloide35. Estos resultados muestran que los filamentos de amiloide no siempre adoptan estructuras repetitivas uniformes. Por lo tanto, la variabilidad estructural de los filamentos de amiloide TDP-43 puede tener implicaciones para el desarrollo de compuestos diagnósticos y terapéuticos.

La cadena lateral de R293 está completamente enterrada en la conformación principal del pliegue de chevron, y su carga positiva se compensa solo parcialmente mediante enlaces de hidrógeno con los grupos peptídicos circundantes (Fig. 3a). Se espera que el efecto general de esta carga enterrada sea desestabilizador. Propusimos la hipótesis de que el entierro de este residuo puede haber sido facilitado por la citrulinación (desiminación) de modificación postraduccional, en la que el grupo guanidinio cargado de arginina se hidroliza, produciendo un grupo ureido neutro (Fig. 3b). El análisis de los filamentos de los cerebros de los individuos con FTLD-TDP tipo A mediante espectrometría de masas estableció la presencia de moléculas de TDP-43 que estaban citrulinadas en R293 (Datos ampliados, figura 7). Nuestros resultados indican que la citrulinación puede facilitar la formación de filamentos TDP-43 en FTLD-TDP tipo A al eliminar la carga de R293.

a – c, mapas Cryo-EM y modelos atómicos de filamentos TDP-43 de FTLD-TDP tipo A alrededor de R293 con la conformación principal de la región N-terminal y R293 (a) sin modificar, la conformación principal de la región N-terminal y R293 citrulinado (CitR293) (b), y la conformación alternativa de la región N-terminal y R293 monometilado (MetR293) (c). Los mapas y modelos se muestran para una única molécula de TDP-43 perpendicular al eje helicoidal. Los enlaces de hidrógeno con las cadenas laterales de R293 modificado y sin modificar se muestran como líneas magenta discontinuas.

Nuestro análisis de espectrometría de masas también reveló que R293 estaba monometilado en algunas moléculas de TDP-43 (Datos ampliados, figura 8). La monometilación de R293 también se ha observado previamente en condiciones fisiológicas36. El metil-R293 es incompatible con la conformación principal del pliegue del filamento, debido a choques estéricos, y solo puede acomodarse en la conformación alternativa de la región N-terminal, donde su cadena lateral está expuesta (Fig. 3c). Como esta conformación alternativa es rara, R293 sólo puede metilarse en una minoría de moléculas de TDP-43. Se ha informado que la monometilación de R293 reduce el ensamblaje de TDP-43 in vitro37.

La arginina 293 se encuentra en el único motivo RGG/RG del LCD TDP-43. Los motivos RGG/RG participan en interacciones funcionales de proteínas de unión a ARN y están regulados por la citrulinación y metilación de arginina38. La peptidil-arginina deiminasa 4 (PAD4) puede citrulinar residuos de arginina en motivos RGG39, y varias peptidil-arginina metiltransferasas pueden apuntar a este motivo38. En varias enfermedades neurodegenerativas se ha observado un aumento de la actividad de la PAD y de la citrulinación de proteínas40. Quedan por determinar las posibles funciones de la citrulinación y metilación de TDP-43 en R293 en otras afecciones neurodegenerativas, así como en individuos sanos. En conjunto, nuestros resultados indican que las modificaciones postraduccionales de R293 pueden influir en la variación estructural local de los filamentos TDP-43 del FTLD-TDP tipo A al alterar la carga y el tamaño del residuo.

El pliegue en galón del FTLD-TDP tipo A es diferente al pliegue en doble espiral de la ELA con el FTLD-TDP tipo B, lo que demuestra que los distintos pliegues de filamentos de amiloide del TDP-43 caracterizan diferentes condiciones neurodegenerativas (Fig. 4). Esto respalda la noción más amplia de que distintos pliegues de filamentos de amiloide de proteínas específicas subyacen a la enfermedad neurodegenerativa32,41.

a, Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de los elementos de la estructura secundaria de los pliegues del filamento TDP-43 de FTLD-TDP tipo A y de ALS y FTLD-TDP tipo B (PDB 7PY2). El sitio de truncamiento N-terminal en P280 se indica con un símbolo de tijera. R293 está indicado por un punto azul. b, Esquema de los elementos de la estructura secundaria de los pliegues del filamento, mostrado para una sola molécula de TDP-43 perpendicular al eje helicoidal. Las conformaciones locales alternativas del pliegue del filamento FTLD-TDP tipo A son transparentes y R293 está resaltado. En a y b, las flechas indican cadenas β. Se resaltan las regiones ricas en glicina (G274–G310, magenta), hidrófobas (M311–S342, blanco) y ricas en Q/N (Q343–Q360, verde).

El pliegue en forma de galón de FTLD-TDP tipo A está formado por la misma parte del LCD TDP-43 que el pliegue en doble espiral de ALS y FTLD-TDP tipo B, más diez residuos adicionales en el extremo N (R272-G281). Estos residuos adicionales pueden explicar la presencia de CTF distintos en FTLD-TDP tipo A en comparación con ALS y FTLD-TDP42 tipo B. Un modelo celular del ensamblaje de TDP-43 indicó que el truncamiento del terminal N puede ocurrir después de la formación del filamento17. En ALS30 se ha encontrado un CTF que comienza en P280, pero no se pudo generar a partir de la conformación principal del pliegue del filamento tipo A FTLD-TDP.

Los residuos A321-Q331 en la región hidrofóbica forman el nexo de ambos pliegues de filamentos. Estos residuos se conservan y pueden formar hélices α cooperativas y láminas β intermoleculares de importancia funcional43,44. Las diferencias entre los dos pliegues de filamentos surgen de distintas organizaciones estructurales de la región hidrofóbica. En el pliegue de doble espiral, esta región forma dos grupos hidrófobos compactos, mientras que en el pliegue de chevron adopta una conformación extendida debido a su estructura β más extensa, que se estabiliza mediante empaquetamiento en cremallera con hebras β de los ricos en glicina y Regiones ricas en Q/N.

Al igual que el pliegue de doble espiral, las superficies del pliegue de chevron están formadas por regiones ricas en glicina y ricas en Q/N de TDP-43 y carecen de ranuras cargadas (Datos ampliados, Fig. 4i), lo que posiblemente explica la mala unión. de ligandos de imágenes de amiloide20,45. La región rica en Q/N tiene una conformación extendida y una estructura secundaria similar en ambos pliegues, pero las orientaciones interior-exterior de sus cadenas laterales están invertidas. Esto incluye S347 y S350, que están enterrados en el pliegue de doble espiral pero expuestos al solvente en el pliegue de chevron. Recientemente, se identificó la fosforilación de S350 en TDP-43 ensamblado de un individuo con FTLD-TDP tipo A, pero no en individuos con ELA y FTLD-TDP18 tipo B. Queda por determinar si la fosforilación ocurre antes o después de la formación de filamentos.

Veinticuatro mutaciones de TARDBP asociadas a la enfermedad se localizan en la región que forma los pliegues de filamentos de FTLD-TDP tipo A y ELA con FTLD-TDP tipo B. La mayoría de estas mutaciones son compatibles con al menos uno de los pliegues del filamento, mientras que cuatro mutaciones son incompatibles con ambos pliegues (Tabla de datos complementarios 2). Dada la variación estructural observada del pliegue del filamento FTLD-TDP tipo A, no excluimos la posibilidad de que estas mutaciones puedan acomodarse en estos pliegues mediante otras conformaciones locales alternativas. También es posible que los individuos con estas mutaciones tengan diferentes pliegues de filamentos.

Las diferencias entre los dos pliegues de filamentos pueden explicar las distintas capacidades de siembra y toxicidades del TDP-43 ensamblado de FTLD-TDP tipo A y el de ELA y FTLD-TDP tipo B en modelos celulares y animales17,46,47,48. Esto puede ser la base de las distintas patologías de los diferentes tipos de FTLD-TDP. Los diferentes tipos de FTLD-TDP se distinguen por la distribución cerebral del TDP-43 ensamblado (ref. 8), lo que indica que el entorno local puede influir en los pliegues de los filamentos de TDP-43. La producción de pliegues de filamentos asociados a enfermedades en sistemas modelo será clave para probar estas hipótesis. Hasta el momento, los filamentos de TDP-43 ensamblados in vitro no han recapitulado estructuras del cerebro49,50,51.

Aquí, hemos establecido que TDP-43 forma filamentos de amiloide en FTLD-TDP tipo A, como lo hace en ELA con FTLD-TDP9 tipo B. El pliegue en forma de galón del FTLD-TDP tipo A es diferente al pliegue en doble espiral de la ELA y del FTLD-TDP tipo B, lo que demuestra que los distintos pliegues del filamento de amiloide TDP-43 caracterizan diferentes condiciones neurodegenerativas. Las estructuras indican un papel de las modificaciones postraduccionales de la arginina en la formación de filamentos y en la variación estructural de los filamentos individuales. Este trabajo guiará los estudios mecanicistas del ensamblaje de TDP-43, así como el desarrollo de compuestos diagnósticos y terapéuticos dirigidos al TDP-43 ensamblado.

Las muestras de tejido humano procedían de la Biblioteca de Cerebros del Laboratorio de Demencia de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana (individuos 2, 4 y 5) y del Banco de Cerebros de Manchester (individuos 1 y 3). Su uso en este estudio fue aprobado por los procesos de revisión ética de cada institución. Se obtuvo el consentimiento informado de los familiares de los pacientes. Los individuos fueron seleccionados en base a un diagnóstico neuropatológico de FTLD-TDP tipo A, según los criterios establecidos en la ref. 8, así como una falta de neuropatología asociada a enfermedades neurodegenerativas comórbidas. El individuo 2 ha sido descrito anteriormente como el paciente 3 en la ref. 52. Todos los individuos tenían abundantes inclusiones citoplasmáticas neuronales compactas, neuritas distróficas cortas e inclusiones intranucleares neuronales poco frecuentes concentradas en las capas corticales dos y tres que se detectaron utilizando anticuerpos contra el extremo N de TDP-43 y TDP-43 fosforilado en S409 y S410. Todos los individuos recibieron diagnóstico clínico de demencia frontotemporal. Las presentaciones clínicas de los individuos 1, 2, 4 y 5 fueron consistentes con la afasia progresiva primaria variante no fluida, mientras que el individuo 3 presentó síntomas clínicos consistentes con la demencia frontotemporal variante conductual. Anteriormente se había descubierto que estas presentaciones clínicas estaban asociadas con FTLD-TDP8 tipo A. El individuo 3 tenía GRN de tipo salvaje, mientras que los cuatro individuos restantes tenían mutaciones en GRN asociadas con FTLD-TDP tipo A. Todos los individuos tenían números de repetición de hexanucleótido C9orf72 normales. Se proporcionan más detalles clínico-patológicos en la Tabla de datos ampliados 1.

El enriquecimiento del objetivo de secuenciación del exoma completo utilizó la biblioteca de todos los exones humanos SureSelectTX (V6, 58 megapares de bases; Agilent), y la secuenciación de alto rendimiento se llevó a cabo utilizando un HiSeq 4000 (configuración de extremos emparejados de pares de bases sx75; Illumina) . Para detectar expansiones repetidas de hexanucleótidos en el gen C9orf72, realizamos una PCR con cebado repetido seguida de análisis de longitud de fragmentos como se describió anteriormente53. Se utilizaron oligonucleótidos diseñados para amplificar los exones codificantes y las regiones intrónicas flanqueantes correspondientes del gen GRN para la PCR utilizando 50 ng de ADN genómico extraído del tejido cerebral. Los productos amplificados se purificaron y se sometieron a secuenciación didesoxi directa como se describió anteriormente54.

El TDP-43 ensamblado se extrajo de la corteza prefrontal congelada instantáneamente como se describió anteriormente9. Se diseccionó materia gris de la corteza prefrontal congelada instantáneamente y se homogeneizó usando un Polytron (Kinematica) en 40 volúmenes (v/p) de tampón de extracción que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 0,8 M, sacarosa al 10 % y EGTA 1 mM. Se añadió una solución al 25 % de sarkosyl en agua a los homogeneizados para lograr una concentración final de 2 % de sarkosyl. Luego, los homogeneizados se incubaron durante 1 h a 37 °C con agitación orbital a 200 rpm, seguido de centrifugación a 27.000 g durante 10 min. Los sobrenadantes se retuvieron y se centrifugaron a 166.000 g durante 20 min. Los sedimentos se resuspendieron en 6 ml g-1 de tejido de tampón de extracción que contenía 1% de sarkosilo mediante sonicación durante 5 minutos al 50% de amplitud (Qsonica Q700), luego se diluyeron cuatro veces con el mismo tampón y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C con agitación orbital. a 200 rpm. Luego, las muestras se centrifugaron a 17.000 g durante 5 minutos y los sobrenadantes se retuvieron y se centrifugaron a 166.000 g durante 20 minutos. Los sedimentos se resuspendieron en 1 ml g-1 de tejido de tampón de extracción que contenía 1% de sarkosilo mediante incubación durante 1 h a 37 °C con agitación orbital a 200 rpm. Las muestras se centrifugaron a 100.000 g durante 20 minutos y los sedimentos se resuspendieron en 30 µl g-1 de tejido de Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM mediante sonicación durante 5 minutos con una amplitud del 50 % (Qsonica Q700). Se utilizaron de uno a dos gramos de tejido para cada muestra crio-EM. Todos los pasos de centrifugación se llevaron a cabo a 25 °C.

Para la histología, los hemisferios cerebrales se fijaron con formalina tamponada al 10% y se incluyeron en parafina. Se incubaron secciones desparafinadas (8 μm de espesor) en tampón citrato de sodio 10 mM a 105 °C durante 10 minutos y se trataron con ácido fórmico al 95% durante 5 minutos. Después del lavado, las secciones se bloquearon con suero fetal de ternera al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios contra el extremo N de TDP-43 (Abcam ab57105, 1:10,000, o Proteintech 10782-2-AP, 1:2000) y pS409/410 TDP-43 (CosmoBio CAC-TIP-PTD-M01, 1:1000) en PBS que contiene suero fetal de ternera al 10%. Después de la incubación de secciones con anticuerpos secundarios biotinilados durante 2 h, se detectó el marcaje utilizando un kit de tinción ABC (Vector) con DAB. Las secciones se tiñeron con hematoxilina.

Para la inmunotransferencia, los extractos de cerebro solubles en sarkosilo e insolubles en sarkosilo se resolvieron utilizando geles BIS-Tris al 12% o al 4-12% (Novex) a 200 V durante 45 minutos y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon en PBS que contenía albúmina sérica bovina al 1 % y Tween al 0,2 % durante 30 min a 21 °C y se incubaron con un anticuerpo primario contra pS409/410 TDP-43 (CosmoBio CAC-TIP-PTD-M01, 1:3000) a 21ºC durante 1h. Luego, las membranas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween al 0,2% y se incubaron con anticuerpos secundarios fluorescentes StarBright Blue 520 (Bio-Rad) o anti-IgG de ratón biotinilados (Vector Lab Inc). Luego, las membranas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween al 0,2% y se tomaron imágenes usando un ChemiDoc MP (Bio-Rad).

Para la microscopía electrónica de tinción negativa con inmunooro, se depositaron extractos de cerebro insolubles en sarkosilo sobre rejillas de cobre de malla 300 recubiertas de carbono (Nissin EM), se bloquearon con gelatina al 0,1 % en PBS y se incubaron con un anticuerpo primario contra pS409/410 TDP-43. (CosmoBio CAC-TIP-PTD-M01) a una dilución de 1:100 en gelatina al 0,1% en PBS a 21 °C durante 3 h. Después de lavar con PBS, las rejillas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con partículas de oro de 10 nm (Cytodiagnostics) en una dilución de 1:20 en gelatina al 0,1% en PBS a 21 °C durante 1 h. Luego se tiñeron las rejillas con acetato de uranilo al 2%. Las imágenes de micrografía electrónica se adquirieron utilizando un microscopio electrónico Thermo Fisher Scientific Tecnai Spirit de 120 keV o un microscopio electrónico JEOL JEM-1400 de 80 keV equipado con cámaras de dispositivo de carga acoplada.

El TDP-43 ensamblado extraído de 0,1 g de tejido se incubó con 0,4 mg ml-1 de pronasa (Sigma) durante 1 hora a 21 °C y se sedimentó mediante centrifugación a 166.000 g durante 20 minutos. El sedimento se resuspendió en 100 µl de hexafluoroisopropanol y se incubó a 37 °C durante la noche. Luego, los sedimentos resuspendidos se sonicaron durante 2 minutos con una amplitud del 50% (QSonica Q700), seguido de una incubación a 37 °C durante 2 h. Este ciclo de sonicación e incubación se repitió hasta que todo el material estuvo visiblemente resuspendido. Los sedimentos resuspendidos se centrifugaron a 166.000 g durante 15 minutos y el sobrenadante se recogió y se secó mediante centrifugación al vacío (Savant). Las muestras de proteína seca se resuspendieron en bicarbonato de amonio 50 mM que contenía urea 8 M, se redujeron con DTT 5 mM a 56 °C durante 30 minutos y se alquilaron con yodoacetamida 10 mM en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras se diluyeron con urea 1 M con bicarbonato de amonio 50 mM y se incubaron con quimotripsina (Promega) a 25 °C durante la noche. La digestión con proteasa se detuvo mediante la adición de ácido fórmico hasta una concentración final del 0,5%. Luego, las muestras se centrifugaron a 16.000 g durante 5 minutos y los sobrenadantes se desalinizaron y fraccionaron utilizando puntas C18 de extracción intermitente (STAGE) hechas a medida (3M Empore) empaquetadas con resina oligo R3 porosa (Thermo Fisher). Las puntas STAGE se equilibraron con 80 % de acetonitrilo (MeCN) que contenía 0,5 % de ácido fórmico, seguido de 0,5 % de ácido fórmico. Los péptidos unidos se eluyeron paso a paso con MeCN a concentraciones que aumentaban del 5 % al 60 % de MeCN en bicarbonato de amonio 10 mM y se secaron parcialmente mediante centrifugación al vacío (Savant).

Los péptidos fraccionados se analizaron mediante cromatografía líquida acoplada con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) utilizando un sistema Ultimate 3000 RSLCnano totalmente automatizado (Thermo Fisher). Los péptidos se atraparon mediante una columna nanotrampa PepMap 100 C18 de 100 μm × 2 cm (Thermo Scientific) y se separaron en una columna nanoEase M/Z HSS C18 T3 de 75 μm × 25 cm (Waters) utilizando un gradiente binario formado por MeCN al 2 % en 0,1% de ácido fórmico (tampón A) y 80% de MeCN en 0,1% de ácido fórmico (tampón B) a un caudal de 300 nl min-1. Los péptidos eluidos se introdujeron directamente utilizando una fuente de iones nanoFlex en un espectrómetro de masas Orbitrap Eclipse (Thermo Fisher). Los espectros MS1 se adquirieron con una resolución de 120K, un rango de masas de 380–1400 m/z, un objetivo de control automático de ganancia de 4e5, un tiempo máximo de inyección de 50 ms y una exclusión dinámica de 60 s. El análisis MS2 se llevó a cabo con detección orbitrap de activación de disociación colisional de mayor energía con una resolución de 15K, objetivo de control automático de ganancia de 5e4, tiempo máximo de inyección de 50 ms, energía de colisión normalizada del 30% y ventana de aislamiento de 1,2 m/z.

Los datos de LC-MS/MS se buscaron en la base de datos revisada por humanos (UniProtKB/Swiss-Prot, versión 2019_03) utilizando Mascot (Matrix Science, v.2.4). Los parámetros de búsqueda en la base de datos se establecieron con una tolerancia de precursores de 10 ppm y una tolerancia de masa de iones de fragmentos de 0,1 Da. Se permitió un máximo de tres escisiones de quimotripsina omitidas. La carbamidometilcisteína se estableció como modificación estática. La oxidación de metionina, la citrulinación y metilación de arginina y la desaminación de asparagina y glutamina se especificaron como modificaciones variables. Se utilizó Scaffold (v.4, Proteome Software Inc.) para validar las identificaciones de proteínas y péptidos basadas en MS/MS. Los espectros MS/MS que contienen citrulinación y metilación de arginina se confirmaron manualmente.

El TDP-43 ensamblado extraído se incubó con 0,4 mg ml-1 de pronasa (Sigma) durante 1 h a 21 °C y se centrifugó a 3000 g durante 15 s. Los sobrenadantes se retuvieron y se aplicaron a rejillas de oro de malla 300 recubiertas de carbono con agujeros de 1,2/1,3 μm descargadas luminiscentemente (Quantifoil) y se congelaron por inmersión en etano líquido utilizando un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher). Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio Titan Krios de 300 keV (Thermo Fisher) equipado con un detector K3 (Gatan) y un filtro de energía GIF Quantum (Gatan) operado con un ancho de rendija de 20 eV. Durante la adquisición de imágenes se utilizó un cambio de imagen sin aberraciones en el software EPU (Thermo Fisher). Se proporcionan más detalles en la Tabla 2 de datos ampliados.

Los fotogramas de vídeo se corrigieron en ganancia, se alinearon, se ponderaron en dosis y se sumaron utilizando el programa de corrección de movimiento en RELION-4.0 (ref. 55). Las micrografías con corrección de movimiento se utilizaron para estimar la función de transferencia de contraste utilizando CTFFIND-4.1 (ref. 56). Todo el procesamiento de imágenes posterior utilizó métodos de reconstrucción helicoidal en RELION-4.0 (refs. 57,58). Los filamentos de TDP-43 se recogieron manualmente y se realizó una clasificación bidimensional (2D) sin referencias para eliminar los segmentos subóptimos. Los modelos de referencia 3D iniciales se generaron de novo produciendo sinogramas a partir de promedios de clases 2D como se describió anteriormente59. Luego, se realizaron autorrefinamientos 3D con optimización del giro helicoidal, seguidos de pulido bayesiano y refinamiento de la función de transferencia de contraste55,60; Se utilizó la clasificación 3D para eliminar aún más los segmentos subóptimos, así como para separar segmentos con diferentes conformaciones de giro; y luego se repitieron el refinamiento automático 3D, el pulido bayesiano y el refinamiento de la función de transferencia de contraste. Las reconstrucciones finales se perfeccionaron utilizando los procedimientos de posprocesamiento estándar en RELION-4.0, y las resoluciones generales se estimaron a partir de correlaciones de capa de Fourier de 0,143 entre los dos medios mapas refinados de forma independiente, utilizando aleatorización de fase para corregir los efectos de convolución de un generoso, de bordes suaves. máscara solvente61. Las estimaciones de resolución local se obtuvieron utilizando el mismo procedimiento de aleatorización de fases pero con una máscara esférica suave que se movía por todo el mapa. La simetría helicoidal se impuso utilizando RELION Helix Toolbox. Se proporcionan más detalles en la Tabla 2 de datos ampliados.

Los modelos atómicos se construyeron de novo y se perfeccionaron en el espacio real en COOT62 utilizando los mapas mejor resueltos. La reconstrucción mediante dinámica molecular se llevó a cabo en ISOLDE63. Los modelos se refinaron en el espacio de Fourier usando REFMAC5 (ref. 64), con restricciones de simetría apropiadas definidas usando Servalcat65. Para confirmar la ausencia de sobreajuste, el modelo se agitó, se refinó en el espacio de Fourier contra el primer medio mapa utilizando REFMAC5 y se comparó con el segundo medio mapa. La geometría se validó utilizando MolProbity66. ChimeraX67 se utilizó para análisis y gráficos moleculares. Las estadísticas del modelo se dan en la Tabla de datos ampliados 2.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos del exoma completo se han depositado en el sitio de almacenamiento de datos de la enfermedad de Alzheimer del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento con el código de acceso NG00107. Los datos de espectrometría de masas se han depositado en la base de datos de Proteomics Identifications con los números de acceso PXD040102 y PXD043731. Los conjuntos de datos de Cryo-EM se han depositado en el Archivo de imágenes públicas de microscopía electrónica con los códigos de acceso EMPIAR-11438 para el individuo 1, EMPIAR-11428 para el individuo 2 y EMPIAR-11429 para el individuo 3. Los mapas de Cryo-EM se han depositado en el Archivo de datos de microscopía electrónica. Banco con códigos de acceso EMD-16628 para individuo 1, variante 1; EMD-16642 para individuo 1, variante 2; EMD-16643 para el individuo 1, variante 3; EMD-16677 para individuo 2, variante 1; EMD-16681 para individuo 2, variante 2; y EMD-16682 para el individuo 3, variante 1. Los modelos atómicos se han depositado en el Protein Data Bank con los códigos de acceso 8CG3 para la variante 1, 8CGG para la variante 2 y 8CGH para la variante 3. El modelo atómico de filamentos TDP-43 de individuos con ALS y FTLD-TDP tipo B están disponibles en el Protein Data Bank con el código de acceso 7PY2.

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Agradecemos a las personas y sus familias por donar tejido cerebral; el Manchester Brain Bank, que forma parte de la Iniciativa de Investigación Brains for Dementia, financiada conjuntamente por la Alzheimer's Society y Alzheimer's Research UK, para suministrar tejido de los individuos 1 y 3; JH Grafman por suministrar tejido del individuo 4; el Repositorio Nacional Centralizado para la Enfermedad de Alzheimer y Demencias Relacionadas, que recibe financiación del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento, para suministrar tejido del individuo 5; el Centro de Genómica Médica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana para la secuenciación de ADN de próxima generación; MH Jacobsen por su ayuda con los exámenes neuropatológicos; R. Otani por su ayuda con el inmunomarcaje; M. Tahira por su ayuda con la espectrometría de masas; K. Yamashita y G. Murshudov por su ayuda con Servalcat y mejoras del modelo en REFMAC5; personal del Laboratorio de Biología Molecular del MRC, Instalación de Microscopía Electrónica para acceso y apoyo con crio-EM; personal del Centro de Computación Científica del Laboratorio de Biología Molecular del MRC para acceso y soporte informático; personal del Laboratorio de Biología Molecular del MRC, Instalación de Espectrometría de Masas para acceso y apoyo con espectrometría de masas; y TS Behr, A. Bertolotti, SW Davies, M. Goedert, SHW Scheres y S. Tetter para las discusiones. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación Médica, como parte de Investigación e Innovación del Reino Unido (MC_UP_1201/25 a BR-F.); un premio Alzheimer's Research UK Rising Star (ARUK-RS2019-001 a BR-F.); los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (P30-AG010133, U01-NS110437 y RF1-AG071177 para RV y BG); la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (JP20dm0207072 de MH); la Investigación Central de la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología para la Ciencia y Tecnología Evolutivas (JPMJCR18H3 a MH); una beca de posgrado de Cambridge Commonwealth, European & International Trust para RC; y una beca de carrera temprana Leverhulme (ECF-2022-610 para DA). A efectos de acceso abierto, el Laboratorio de Biología Molecular del MRC ha aplicado una licencia de derechos de autor pública CC BY a cualquier versión manuscrita aceptada por el autor que surja.

Laboratorio de Biología Molecular del MRC, Cambridge, Reino Unido

Diana Arseni, Renren Chen, Alexey G. Murzin, Sew Y. Peak-Chew y Benjamin Ryskeldi-Falcon

Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana, Indianápolis, IN, EE. UU.

Holly J. Garringer, Kathy L. Newell, Rubén Vidal y Bernardino Ghetti

Departamento de Cerebro y Neurociencias, Instituto Metropolitano de Ciencias Médicas de Tokio, Tokio, Japón

Fuyuki Kametani y Masato Hasegawa

División de Neurociencia, Facultad de Biología, Medicina y Salud, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Manchester, Salford Royal Hospital, Salford, Reino Unido

Andrew C.Robinson

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KLN, BG y MH identificaron a las personas. ACR y BG realizaron exámenes neuropatológicos. ACR, BG y MH realizaron inmunohistoquímica. HJG y RV realizaron análisis genéticos. DA, RC y MH extrajeron filamentos TDP-43. DA, FK y MH realizaron análisis bioquímicos. RC, SYP-C. y FK recopiló y analizó datos de espectrometría de masas. DA recopiló datos crio-EM. DA, AGM y BR-F. analizaron datos crio-EM. BR-F. supervisó el estudio. Todos los autores contribuyeron a escribir el manuscrito. BG, MH y BR-F. son los autores principales.

Correspondencia a Benjamin Ryskeldi-Falcon.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a James Shorter y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, b, Inmunohistoquímica para TDP-43 (marrón) en la corteza prefrontal de los individuos 1 a 5 con anticuerpos contra TDP-43 N-terminal (a) y TDP-43 fosforilado en S409 y S410 (b). Las secciones se tiñeron con hematoxilina (azul). Barras de escala, 25 μm. c, Inmunotransferencias de las fracciones solubles en sarkosilo e insolubles en sarkosilo de la corteza prefrontal de los individuos 1 a 3 y un caso de control sin patología de TDP-43 (C) con un anticuerpo contra TDP-43 fosforilado en S409 y S410. Para obtener datos de la fuente del gel, consulte la Fig. 1. d complementaria, imágenes Cryo-EM de filamentos TDP-43 de la corteza prefrontal de los individuos 1 a 3. Barra de escala, 50 nm. e, Imágenes EM con tinción negativa de inmuno-oro de filamentos de TDP-43 de la corteza prefrontal de los individuos 1 y 2 con un anticuerpo contra TDP-43 fosforilado en S409 y S410. Barras de escala, 100 nm. Para a – e, se obtuvieron resultados similares en al menos tres experimentos independientes.

a, curvas de correlación de capa de Fourier (FSC) para los dos semimapas crio-EM refinados independientemente de filamentos TDP-43 de FTLD-TDP tipo A (línea negra); para el modelo atómico refinado frente al mapa de densidad crio-EM (magenta); para el modelo atómico agitado y refinado usando el primer medio mapa contra el primer medio mapa (cian); y para el mismo modelo atómico contra la segunda mitad del mapa (amarillo). Se muestran los umbrales de FSC de 0,143 (línea discontinua negra) y 0,5 (línea discontinua magenta). b, Estimación de la resolución local para el mapa de densidad crio-EM. c, mapa de densidad Cryo-EM visto a lo largo del eje helicoidal. Barra de escala, 10 Å. d, e, Vistas del mapa de densidad crio-EM y del modelo atómico que muestran densidades representativas para el solvente ordenado (flechas rojas) (d) y los átomos de oxígeno de la cadena principal en las cadenas β, que revelan la quiralidad del mapa (e).

a, Imágenes crio-EM de filamentos TMEM106B de la corteza prefrontal de los individuos 1 a 3. Las flechas indican ejemplos de filamentos TMEM106B simples (cian) y dobles (magenta). Barras de escala, 100 nm. Se obtuvieron resultados similares en al menos tres experimentos independientes. b, Cobertura del péptido TMEM106B por espectrometría de masas de la corteza prefrontal de los individuos 1-3. Los péptidos se asignan a la región que forma el núcleo ordenado de los filamentos de TMEM106B, con la excepción de un péptido del individuo 2, que se asigna a la hélice transmembrana (TM) de TMEM106B. Los recuentos se dan para cada péptido. Las secuencias de péptidos se muestran en la Tabla de datos complementarios 1.

a, Representación esquemática del pliegue FTLD-TDP tipo A. b, mapa Cryo-EM y modelo atómico, mostrados para la región rica en Q/N de cinco moléculas de TDP-43 en línea con el eje helicoidal. c – e, estructura secundaria del pliegue FTLD-TDP tipo A, que se muestra para una única molécula de TDP-43 perpendicular al eje helicoidal con las cinco capas resaltadas en diferentes colores (c); se muestra para cinco moléculas de TDP-43 en línea con el eje helicoidal (d); y se muestra para una sola molécula de TDP-43 perpendicular al eje helicoidal con regiones de empaquetamiento con cremallera resaltadas en naranja (e). f, modelo atómico del pliegue que representa los enlaces de hidrógeno intramoleculares (líneas discontinuas cian), mostrado para tres moléculas de TDP-43 perpendiculares al eje helicoidal. g, Hidrofobicidad del pliegue desde el más hidrófilo (cian) hasta el más hidrófobo (amarillo), mostrado para una única molécula de TDP-43 perpendicular al eje helicoidal. El asterisco rojo indica el grupo hidrofóbico formado en la interfaz de la segunda y tercera capas. h, Vista del modelo atómico y densidades no proteicas, mostradas para cinco moléculas de TDP-43 en línea con el eje helicoidal. i, Representación superficial del pliegue, mostrada para una única molécula de TDP-43 perpendicular al eje helicoidal. Para b, d, f, se resaltan las regiones ricas en glicina (G274 – G310, magenta), hidrófobas (M311 – S342, blanco) y ricas en Q/N (Q343 – Q360, verde).

a, mapas Cryo-EM de filamentos TDP-43 de FTLD-TDP tipo A con diferentes conformaciones locales de la región N-terminal (flechas cian) y del giro que conecta la cuarta capa con la quinta (flechas amarillas), mostrados como central cortes perpendiculares al eje helicoidal. Barras de escala, 25 Å. b, curvas de correlación de capa de Fourier (FSC) para los dos semimapas crio-EM refinados independientemente (líneas negras); para el modelo atómico refinado frente al mapa de densidad crio-EM (magenta); para el modelo atómico agitado y refinado usando el primer medio mapa contra el primer medio mapa (cian); y para el mismo modelo atómico contra el segundo medio mapa (amarillo). Se muestran los umbrales de FSC de 0,143 (línea discontinua negra) y 0,5 (línea discontinua magenta). c, Estimaciones de resolución local para los mapas de densidad crio-EM. d, mapas de densidad Cryo-EM vistos a lo largo del eje helicoidal. Barra de escala, 10 Å. e, mapas de densidad Cryo-EM y modelos atómicos, mostrados para una sola molécula de TDP-43 perpendicular al eje helicoidal.

Micrografías de ejemplo de filamentos TDP-43 del individuo 1 FTLD-TDP tipo A que muestran las posiciones de los segmentos de filamentos que contribuyen a mapas crio-EM con diferentes conformaciones locales, que pueden ocurrir dentro de filamentos individuales. Los segmentos de filamento con las principales conformaciones locales se muestran en cian; con la conformación local alternativa de la región N-terminal en magenta; y con la conformación local alternativa de la región N-terminal y el giro que conecta la cuarta capa con la quinta en amarillo. Barra de escala, 100 nm.

Espectros de masas de péptidos TDP-43 que contienen R293 citrulinado de filamentos de TDP-43 aislados de la corteza prefrontal de los individuos 1 a 5.

Espectros de masas de péptidos TDP-43 que contienen R293 monometilado de filamentos de TDP-43 aislados de la corteza prefrontal de los individuos 1 y 2. Dichos péptidos no se detectaron en los individuos 3 a 5, posiblemente porque hay menos péptidos totales que contienen R293 de TDP-43. Se detectaron para estos individuos en comparación con los individuos 1 y 2.

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Reimpresiones y permisos

Arseni, D., Chen, R., Murzin, AG et al. TDP-43 forma filamentos amiloides con un pliegue distinto en el FTLD-TDP tipo A. Naturaleza (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06405-w

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Recibido: 10 de febrero de 2023

Aceptado: 05 de julio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06405-w

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