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Apr 20, 2024

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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 11687 (2023) Citar este artículo 255 Accesos 1 Altmetric Detalles de métricas Candida albicans, un hongo común de la flora humana, puede convertirse en un hongo oportunista

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11687 (2023) Citar este artículo

255 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

Candida albicans, un hongo común de la flora humana, puede convertirse en un patógeno oportunista y causar candidiasis invasiva en personas inmunodeprimidas. La formación de biopelículas es la principal causa de resistencia a los antibióticos durante las infecciones por C. albicans y el tratamiento de las células formadoras de biopelículas es un desafío debido a su naturaleza intratable y persistente. El estudio pretende explorar el potencial terapéutico de los compuestos producidos naturalmente por bacterias marinas competitivas que residen en biopelículas marinas contra la biopelícula de C. albicans. Con este fin, se descubrió que la 3-hidroxicumarina (3HC), un compuesto identificado a partir del sobrenadante del cultivo libre de células de la bacteria marina Brevundimonas abyssalis, exhibe actividad antibiopelícula y antihifas contra aislados clínicos y de referencia de C. albicans. El compuesto demostró efectos inhibidores significativos sobre las biopelículas y afectó la transición de levadura a hifa, las arrugas y la morfología de los filamentos a la concentración mínima inhibidora de biopelículas (MBIC) de 250 µg ml-1. Curiosamente, el análisis cuantitativo por PCR de la biopelícula de C. albicans tratada con 3HC reveló una regulación negativa significativa de los genes de virulencia (hst7, ume6, efg1, cph1, ras1, als1) asociados con la adhesión y la morfogénesis. Además, el 3HC mostró características no fungicidas ni tóxicas contra los eritrocitos y las células bucales humanas. En conclusión, este estudio demostró que las biopelículas marinas son una fuente oculta de diversos fármacos terapéuticos y que el 3HC podría ser un fármaco potente para tratar las infecciones por C. albicans.

Candida albicans es un hongo polimórfico comensal que generalmente habita en la piel humana y la superficie de las membranas mucosas. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, como falla del sistema inmunológico y desequilibrio de la microbiota, esta especie de hongo puede volverse patógena y causar candidiasis oral y vaginal superficial, así como candidiasis invasiva1,2. Los estudios han registrado cerca de 50.000 muertes al año debido a candidiasis invasiva, siendo C. albicans la especie más reportada, representando entre el 40% y el 50% de los casos3,4. El factor principal que favorece la patogénesis de C. albicans es su capacidad para formar biopelículas en superficies bióticas y abióticas, seguido de otros rasgos de virulencia importantes, como las transiciones de levadura a hifas, morfología filamentosa, morfología de arrugas y secreción. de enzimas proteolíticas y lipolíticas5. Además, los rasgos de virulencia, incluida la adhesión, las hifas y la formación de biopelículas, permiten a C. albicans acceder a los tejidos profundos para infecciones sistémicas. La lucha contra los rasgos de virulencia de C. albicans implica cuatro clases principales de fármacos antifúngicos, incluidos polienos, equinocandinas, análogos de nucleósidos y azoles6,7. Sin embargo, se ha descubierto que la formación de biopelículas por C. albicans gana resistencia genética contra la mayoría de los fármacos antimicóticos utilizados actualmente. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de agentes terapéuticos alternativos para luchar contra las infecciones mediadas por biopelículas y superar las limitaciones de las terapias antimicóticas actuales. En este entorno, la búsqueda de nuevos compuestos anti-Candida es imperativa, particularmente en entornos naturales como el marino.

La explotación de productos naturales, como compuestos derivados de bacterias marinas, ofrece nuevas perspectivas para el desarrollo de nuevas entidades farmacológicas. En condiciones ambientales naturales, las biopelículas marinas consisten en comunidades bacterianas de múltiples especies muy cercanas, con un gran intercambio de metabolitos y proteínas, así como estilos de vida coordinados. Estas interacciones complejas pueden beneficiar o dañar a los grupos bacterianos que interactúan y ayudar a los consorcios bacterianos a mantener el equilibrio ecológico. Por ejemplo, las comunidades bacterianas residentes establecen interacciones cooperativas (beneficiosas) o competitivas (dañinas), que afectan la sucesión de biopelículas, la biomasa y la resistencia al estrés. Varios estudios independientes han demostrado que las bacterias asociadas a la superficie producen compuestos bioactivos con importancia clínica, incluidos antibióticos y agentes antibiopelículas8,9,10. Estos agentes bioactivos permiten anular la competencia por la colonización de superficies. Nuestra hipótesis es que algunos de estos compuestos bioactivos pueden usarse ventajosamente para inhibir patógenos humanos.

Una gran cantidad de estudios han identificado compuestos derivados del medio marino como posibles inhibidores de la formación de biopelículas en patógenos bacterianos11,12,13 y hongos14,15,16,17,18,19,20,21. Sin embargo, estos compuestos suelen estar asociados con agua de mar o sedimentos, donde la comunidad bacteriana residente experimenta menos competencia. Es más probable que los compuestos que se originan en entornos naturalmente competitivos, como las biopelículas marinas, posean un mayor potencial para inhibir la virulencia de otros organismos.

En esta investigación, obtuvimos potentes aislados bacterianos formadores de biopelículas a partir de la biopelícula en etapa inicial formada en tres superficies artificiales diferentes (acero inoxidable, polietileno de alta densidad y titanio) sumergidas en el área de entrada de una planta de energía ubicada en la costa22. Se analizó el sobrenadante del cultivo libre de células (CFCS) de los aislados bacterianos para determinar su potente eficacia antibiopelícula contra C. albicans y los compuestos activos se identificaron mediante análisis HR-LCMS de los CFCS seleccionados. Luego examinamos la actividad antibiopelícula del compuesto bioactivo líder contra C. albicans y exploramos los mecanismos subyacentes. El principal objetivo de este trabajo de investigación es alterar la multicelularidad de la biopelícula de C. albicans para restablecer la eficacia del mecanismo de defensa del huésped.

En el presente estudio, recolectamos células epiteliales bucales humanas (HBEC) y eritrocitos humanos frotando suavemente ambos lados de la boca con hisopos de algodón esterilizados y mediante punción venosa, respectivamente. Ambas muestras se recolectaron de individuos sanos y se obtuvo el consentimiento por escrito después de explicar el propósito de la recolección de la muestra y la investigación en su idioma nativo. El protocolo experimental para la obtención de HBEC y sangre fue aprobado por el Comité de Ética Institucional de la Universidad de Alagappa, Karaikudi (IEC Ref. No.: IEC/AU/2018/5). Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes y se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos y/o sus tutores legales.

Todos los experimentos en el presente estudio se realizaron utilizando una cepa de C. albicans de referencia (C. albicans 90028) de la ATCC y tres aislados clínicos (designados como CI 1, CI 2 y CI 3), que se recolectaron originalmente de Candida- Pacientes infectados en un hospital gubernamental en Coimbatore, Tamil Nadu, India. Los tres aislados clínicos se identificaron a nivel de especie en nuestro estudio anterior23 basándose en la secuenciación del gen espaciador transcrito interno (ITS) (números de acceso de GenBank: MF423465–MF423467). La cepa de referencia de C. albicans 90028 y otros aislados clínicos se mantuvieron en placas de agar con peptona y dextrosa con extracto de levadura (YEPD; 1 % de extracto de levadura, 2 % de peptona y 2 % de dextrosa) a 4 ℃. También se mantuvo un stock de glicerol al 30% y se almacenó en un ultracongelador a -80 ℃ de temperatura para su uso posterior. Para el cultivo de rutina y los ensayos de células planctónicas in vitro, se utilizó caldo YEPD y el cultivo se cultivó a 37 ℃ con agitación constante a 160 rpm. Para realizar experimentos de biopelículas se utilizó un medio Spider especializado que incluía 1% de manitol, 0,2% de hidrogenofosfato dipotásico y 1% de caldo nutritivo. Además, se utilizaron medio RPMI (HiMedia Ltd., India) y medio Spider suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 % para todos los experimentos de transición de levadura a hifal y de hifal a levadura13,24. Para simular el ambiente bucal e investigar las posibles propiedades antibiopelículas, el estudio utilizó saliva artificial y la composición se preparó siguiendo la metodología descrita en la literatura anterior25,26.

Los aislados bacterianos utilizados en este estudio se aislaron originalmente de biopelículas marinas en etapa inicial desarrolladas en varias superficies artificiales, como acero inoxidable, polietileno de alta densidad y titanio, en el área de entrada de una planta de energía nuclear ubicada en la costa, ubicada en la costa sur de la India22. Brevemente, las biopelículas desarrolladas en las superficies artificiales se rasparon con cepillos de dientes esterilizados y se suspendieron en agua de mar esterilizada. Las biopelículas suspendidas se transportaron al laboratorio en condiciones heladas y se esparcieron inmediatamente en varios medios de crecimiento, incluido el agar marino Zobell 2216 (ZMA, HiMedia Ltd., India), el agar Luria Bertani y el agar artificial con sal marina (HiMedia Ltd. ., India), para obtener una amplia gama de aislados bacterianos cultivables. Todas las placas se incubaron a 30 ℃ durante siete días y se controló el crecimiento de los aislados bacterianos cada 24 h. Cada morfotipo bacteriano recién cultivado se recogió con palillos de dientes estériles y se subcultivó en ZMA. Los cultivos axénicos de los morfotipos seleccionados se obtuvieron adicionalmente mediante estrías en cuadrantes y se conservaron como reservas de glicerol a -80 ℃.

Se analizó una colección de 60 aislados bacterianos obtenidos de la biopelícula marina natural para determinar su capacidad para inhibir la formación de biopelículas por C. albicans, como se describió anteriormente23. Brevemente, los aislados bacterianos se cultivaron en caldo marino Zobell (ZMB, HiMedia Ltd., India) durante la noche y los sobrenadantes del cultivo libre de células (CFCS) se recogieron mediante centrifugación. Los CFCS recolectados se filtraron individualmente usando filtros de jeringa de 0,22 µm. Todo el cribado se realizó por triplicado experimental utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos (MTP). Se añadieron CFCS filtrados (10 % v/v) al medio Spider que contenía una densidad adecuada de células de cepa 90028 de C. albicans (106 UFC/ml). Luego, las placas cultivadas se incubaron a 37 ºC durante 48 h para facilitar la formación de biopelículas. Además de este grupo experimental, también se implementaron medidas de control adecuadas, incluido un control apropiado, control de vehículos y control negativo.

Después del período de incubación, se descartó la fracción de células planctónicas y se lavaron suavemente las MTP con solución salina estéril para eliminar las células poco adheridas. Luego, las placas se secaron al aire y se añadió una solución de violeta cristal (CV) al 0,4% para teñir la biopelícula formada en la superficie interna de los pocillos. El CV unido a las células formadoras de biopelículas se resuspendió en 200 µl de solución de ácido acético al 30 %, la densidad óptica (OD) se midió a 570 nm y se expresó como biomasa de biopelícula27. Aquí, los pocillos que contenían células de C. albicans pero sin ningún tratamiento bacteriano con CFCS se consideraron como control para determinar la reducción de biomasa-biopelícula. Según los resultados del examen, un aislado de bacteria marina, 6HZ5 (el quinto aislado identificado a partir de una biopelícula de 6 días formada en un cupón de polietileno de alta densidad y cultivado en agar marino Zobell), mostró una actividad antibiopelícula prometedora y, por lo tanto, fue seleccionado. para una mayor investigación.

Se extrajo ADN genómico del aislado bacteriano seleccionado usando el kit microbiano DNeasy PowerLyzer (Qiagen, Cat. No.: 12255-50) y se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el gen 16S rRNA usando cebadores bacterianos universales: 27F (5 ′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′) y 1390R (5′-GACGGGCGGTGTTACAA-3′) como se describe en nuestros estudios anteriores27. Los amplicones se secuenciaron utilizando el kit de secuenciación de ciclos BigDye Terminator v3.1 (Thermo Fisher Scientific, India) en un analizador genético Applied Biosystems 3130 (Applied Biosystems, EE. UU.). Las secuencias recortadas y editadas obtenidas de la secuenciación de Sanger se ensamblaron en el programa de ensamblaje CAP3 Contig y la secuencia concatenada se comparó con las secuencias del gen 16S rRNA disponibles en la base de datos GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) utilizando el algoritmo BLAST27,28. Finalmente, se envió una secuencia del gen 16S rRNA casi completa al NCBI-GenBank con el código de acceso MZ357100. Además, se construyó un árbol filogenético basado en la secuencia del gen 16S rRNA obtenida en este estudio y otras secuencias de referencia como se describió anteriormente utilizando el método de máxima verosimilitud (1000 réplicas de arranque) en el software MEGA (versión 11).

El aislado bacteriano seleccionado (6HZ5), que mostró una potente actividad antibiopelícula contra C. albicans, se cultivó en caldo marino Zobell (ZMB, HiMedia Ltd., India) a 30 ºC en condiciones de agitación (120 rpm) durante 48 h. Después de la incubación, la suspensión bacteriana se centrifugó para recoger CFCS y los compuestos se extrajeron utilizando el doble del volumen de acetato de etilo. El extracto resultante se secó a 55 °C y se disolvió en agua destilada estéril. Aquí, se confirmó la actividad antibiopelícula del extracto crudo contra C. albicans y se mantuvo a 30 °C para su posterior análisis. Posteriormente, el extracto parcialmente purificado se sometió a análisis LC-MS utilizando el sistema HRLC-MS del analizador de masas Agilent Orbitrap con un modo de fuente de iones dual Agilent Jet Stream Electron Ionization source (AJS ESI)31. Después de cada muestra, se realizó un blanco. Se usó una fase móvil que consistía en 0,1% v/v de ácido fórmico en agua (A) y 10% de agua con 90% de acetonitrilo y 0,1% de ácido fórmico (B). El programa de elución en gradiente fue el siguiente: 5% B isocrático durante 5 min, de 5 a 95% B durante 20 min y 95% B isocrático durante 5 min. El caudal y el límite de presión máxima se establecieron en 300 µL min-1 y 12 000 psig, respectivamente. Se inyectó la muestra (volumen de 3 µL) después del lavado de la aguja. Las condiciones del tiempo de vuelo del cuadrupolo (Q-TOF) fueron las siguientes: flujo de gas −11 ml min−1 a 300 °C, presión del nebulizador: 35 psig, voltaje de la boquilla: 1 kV y voltaje del fragmentador: 175 V. El modo de adquisición fue establezca un rango entre 60 y 1000 m/z a una velocidad de escaneo de 1 espectro s-1.

El análisis LCMS confirmó la presencia de un total de 80 compuestos en el CFCS bacteriano seleccionado. Los abundantes compuestos que estaban disponibles comercialmente se obtuvieron y probaron para determinar su capacidad para inhibir la biopelícula de C. albicans. Los siete compuestos probados en nuestro estudio fueron los siguientes: ácido 11-amino undecanoico, salfredina 6,8-docosanediona, 7-acetoxi-4-metilcumarina, sulfadimidina, moracina D y 3-hidroxicumarina (3HC). Todos los compuestos se obtuvieron de Tokyo Chemical Industry (TCI), Japón, y todos tenían una pureza > 98,0 %. Para probar su eficacia anti-biopelículas, se prepararon soluciones madre de los compuestos adquiridos con respecto a su solubilidad en diferentes solventes (metanol, etanol y agua). Estos compuestos se probaron contra C. albicans en una MTP de 24 pocillos utilizando medios YEPD y Spider para células planctónicas y de biopelícula, respectivamente, como se describió anteriormente32. Cada pocillo se cargó con 1 ml de medio de crecimiento apropiado, 106 UFC/ml de células C. albicans 90028 y compuestos seleccionados a una concentración de 500 µg ml-1. Las MTP se incubaron a 37 ℃ durante 24 h y 48 h para células planctónicas y formadoras de biopelículas, respectivamente. Para evaluar la densidad de células planctónicas, las placas incubadas durante 24 h se leyeron a 600 nm. Por otro lado, las células formadoras de biopelículas se sometieron a un procedimiento experimental similar al de detección bacteriana mencionado anteriormente. Entre los compuestos probados, el 3HC exhibió actividad antibiopelícula potencial contra todas las cepas de C. albicans sin ejercer ninguna influencia sobre las células planctónicas y, por lo tanto, fue seleccionado para estudios posteriores.

Se preparó una solución madre (20 mg ml-1) del compuesto en etanol y se almacenó a 30 ℃ para su uso posterior. Para tener en cuenta el efecto del disolvente, se mantuvo un control de vehículo apropiado en todos los experimentos. La actividad antibiopelícula de 3HC contra cepas de C. albicans se evaluó utilizando el método de dilución en microcaldo estándar sugerido por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2022; documento M100), y como se detalla en estudios anteriores descritos previamente23. Para describir brevemente, se inoculó un inóculo al 1 % de cepas de C. albicans cultivadas durante la noche que comprendían 106 UFC/ml de células en 1 ml de caldo YEPD que contenía concentraciones variables de 3HC (que oscilaban entre 62,5 y 2000 µg ml-1) y se incubó durante 24 h a 37 ℃. En este caso, los pocillos sin tratamiento con 3HC sirvieron como control y los pocillos que contenían solo medio YEPD sirvieron como control negativo. Después de la incubación, la densidad celular se cuantificó midiendo la absorbancia a 600 nm utilizando un espectrofotómetro (Spectra Max 3, Molecular Devices, EE. UU.). Además, también se detectaron 5 µl de células de cada pocillo en placas de Petri con agar YEPD para observar los efectos del crecimiento. Se tomaron imágenes de las placas después de 24 h de incubación a 37 ℃.

La viabilidad metabólica de las células de C. albicans de control y tratadas se midió utilizando el método azul de Alamar [Resazurina (7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona 10-óxido)]33. Brevemente, después de tratar las células con 3HC durante 24 h, las células tratadas y de control se centrifugaron a 8000 g durante 10 minutos y se lavaron suavemente tres veces con solución salina tampón fosfato (PBS, pH 7,4). Las células lavadas se resuspendieron en 1 ml de PBS y luego se agregaron 10 µl de azul de Alamar (10 mg/ml de stock) y se incubaron a 37 ℃ en la oscuridad durante 18 a 24 h para el desarrollo de la fluorescencia. El azul de Alamar en PBS sin las células sirvió como control negativo. Después del período de incubación, las células se centrifugaron y se midió la intensidad de fluorescencia del sobrenadante a 560 nm (excitación) y 590 nm (emisión).

Se utilizó el método de cuantificación de CV estándar (0,4%) (como se sigue para la detección de antibiopelículas) para determinar el MBIC de las cepas de C. albicans32. En resumen, se inocularon 106 células de C. albicans en 1 ml de medio Spider y saliva artificial que contenía concentraciones variables de 3HC (62,5 a 2000 µg ml-1) en MTP de 24 pocillos. La MTP se incubó a 37 °C durante 48 h. Después de la incubación, se descartaron las células planctónicas y los pocillos se lavaron cuidadosamente para eliminar las células poco adheridas. Luego, las placas se tiñeron con CV (0,4%) durante 10 min. El exceso de tinte se eliminó por lavado y el tinte unido a la biopelícula se disolvió en 1 ml de ácido acético al 30%. La inhibición de la biopelícula se midió a 570 nm y se consideró como MBIC un mínimo del 80% de inhibición. El porcentaje de inhibición de biopelículas se determinó mediante la siguiente fórmula:

El colorante de tinción de diacetato de fluoresceína (FDA) se utilizó para evaluar y cuantificar la biomasa de biopelícula viable de cepas de C. albicans34,35. Brevemente, se permitió que 106 células de cepas de C. albicans formaran una biopelícula en MTP de 24 pocillos en presencia y ausencia de 3HC durante 48 h. Después de la incubación, se descartaron las células planctónicas y se mezclaron 0,2 mg ml-1 de medio FDA y RPMI en 1:1 (v/v) recién preparado y se transfirieron a los pocillos de 24 MTP. Las placas se incubaron a 37 ℃ durante 1 h en oscuridad. La intensidad de la fluorescencia se midió con una excitación de 488 nm y una emisión de 530 nm. Además, la placa se enjuagó suavemente con PBS para eliminar el exceso de manchas y se observó bajo un microscopio de fluorescencia.

Para evaluar más a fondo la eficacia de 3HC en la reducción de biopelículas y hifas, el control y las células de C. albicans tratadas con 3HC (en diversas concentraciones) se sometieron a análisis FESEM, de acuerdo con nuestro estudio anterior22. Brevemente, se permitió que las 106 células de C. albicans 90028 formaran biopelículas en un portaobjetos de vidrio durante 48 h en presencia y ausencia de 3HC. Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron suavemente con PBS para eliminar las células poco adheridas y se fijaron con glutaraldehído al 2% recién preparado a 4 ℃ durante 3 h. Luego, las muestras se deshidrataron mediante exposición secuencial a concentraciones crecientes de etanol (20%, 40%, 60%, 80% y 100%) durante 10 minutos cada una. Finalmente, las células se secaron al aire y se visualizaron en FESEM (SUPRA 55VP; Carl Zeiss, Alemania).

El efecto de diversas concentraciones de 3HC sobre el crecimiento de filamentos de C. albicans se evaluó en agar YEPD suplementado con FBS al 10%23,24,32. De manera concisa, se agregaron las concentraciones requeridas de 3HC al agar YEPD esterilizado en autoclave y se dejó solidificar. Se colocó una suspensión de cultivo (5 µl que contenía aproximadamente 106 células de C. albicans) en el centro del agar solidificado. El agar YEPD que carecía de 3HC sirvió como control. Se dejaron secar las manchas y las placas se incubaron a 37 °C durante 5 días para que apareciera la morfología del filamento. Las protuberancias (filamentos) en forma de hifa observadas se documentaron utilizando una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) de alta resolución (GelDoc XR+, Bio-Rad).

La morfología de la colonia de C. albicans se evaluó de manera similar a la morfología filamentosa. Se consideró el agar YEPD con diversas concentraciones de 3HC como grupo de tratamiento, mientras que el agar YEPD sin 3HC como control. Se colocó un cultivo de C. albicans (5 µL) en el centro de la placa de agar y se incubó a 37 °C durante 72 h. Los cambios en la morfología se documentaron utilizando un sistema de documentación en gel.

Para investigar el efecto de 3HC en la transición de fase de levadura a hifal, se inoculó el 1% de 106 células de C. albicans en medio YEPD suplementado con 10% de FBS36,37,38. Los grupos de tratamiento recibieron 3HC en diferentes concentraciones, mientras que el grupo de control tenía la misma composición pero sin 3HC. Los tubos inoculados se incubaron a 37 °C con agitación constante a 160 rpm. Después de 4 h de incubación, se documentó la transición de fase utilizando un microscopio óptico.

De manera similar, también se estudió la reversión de hifas a células de levadura induciendo la formación de hifas a partir de células de levadura de C. albicans mediante incubación en medio RPMI durante 4 h a 37 °C38. Después de la incubación, se usó 3HC a diferentes concentraciones para el tratamiento y se observó la transición inversa bajo un microscopio óptico después de 2 h, 4 h y 6 h de incubación.

Para probar la eficacia de 3HC para desintegrar la biopelícula madura, se permitió que C. albicans formara biopelícula en medio Spider durante 48 h. Después de la incubación, el medio gastado se renovó con medio Spider nuevo suplementado con concentraciones variables de 3HC. Los pozos sin tratamiento con 3HC se consideraron como controles. La MTP se incubó adicionalmente durante 3 h para facilitar la acción del 3HC en la biopelícula madura de C. albicans. La eliminación de la biopelícula se registró utilizando el método estándar de tinción CV al 0,4% y microscopía óptica.

El efecto de 3HC sobre el perfil de expresión génica de la cepa 90028 de C. albicans de referencia se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), siguiendo el método descrito anteriormente23,32. De manera concisa, se aisló ARN tanto de las células control como de las tratadas con 3HC (en MBIC) utilizando el método TRIzol (reactivo TRI, Sigma-Aldrich, India). La calidad del ARN aislado se verificó y se cuantificó mediante electroforesis en gel de agarosa y un espectrofotómetro NanoDrop (NanoDrop Technologies, EE. UU.), respectivamente, y luego se convirtió inmediatamente en ADNc utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, EE. UU.). Después de este paso, se realizó qRT-PCR utilizando la mezcla maestra SYBR Green (Applied Biosystems, Estados Unidos). Los cebadores de diferentes genes se agregaron individualmente con la mezcla maestra SYBR Green en una proporción predefinida para lograr un volumen de reacción total de hasta 10 µL. Los genes utilizados en este estudio se consideran cruciales para la patogenicidad de C. albicans y se enumeran en la Tabla 1.

El perfil de expresión de los genes implicados en la formación de biopelículas y la virulencia de C. albicans se estudió con el sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems® 7500. El gen ITS de mantenimiento con un tamaño de ~ 540 pb se usó como control interno y la expresión génica relativa de las células de control y tratadas se determinó usando el método ΔΔCT39.

Se reclutaron voluntarios sanos y se recogieron HBEC frotando suavemente ambos lados de la parte interna de las mejillas con un hisopo de algodón esterilizado. El hisopo se suspendió en PBS estéril y se agitó. Todas las células recolectadas se reunieron y se centrifugaron a 3000 g durante 10 min. El sedimento se lavó tres veces con PBS y se resuspendió en PBS. Las células se ajustaron a ~105 células/ml usando un contador celular automatizado (Countess II FL, Invitrogen, EE. UU.) y se incubaron con concentraciones variables de 3HC. Se utilizó peróxido de hidrógeno como control positivo y las células sin ningún tratamiento sirvieron como control. Después de 20 minutos de incubación a 37 ℃, las células se tiñeron con CV y ​​se observó el efecto tóxico bajo un microscopio óptico32.

Al igual que las HBEC, las HEC también se recolectaron de voluntarios sanos. Aquí, se extrajeron 2 ml de sangre mediante venopunción y se agregaron a un tubo que contenía un anticoagulante (una pizca de EDTA). Las HEC se recogieron mediante centrifugación (2000 g a 10 min) y se lavaron tres veces con PBS. Luego, las células se diluyeron por igual y se trataron con diversas concentraciones de 3HC. En este experimento, se utilizó 1% de Triton X-100 como control positivo para romper las HEC. Los tubos tratados se incubaron durante 1 h a 37 ℃. Los tubos se centrifugaron nuevamente después de la incubación y el sobrenadante se transfirió a un MTP40 de 96 pocillos.

Todos los experimentos se realizaron en al menos tres réplicas biológicas, cada una con un mínimo de tres réplicas experimentales. Los datos mostrados se presentan como media ± desviación estándar (DE). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA), seguido de la prueba post-hoc de Duncan, utilizando R para determinar la significancia dentro y entre los grupos.

Para obtener un potente inhibidor de biopelículas, se analizó la capacidad del CFCS de 60 aislados de bacterias marinas obtenidos de biopelículas marinas en etapa temprana para determinar su capacidad para inhibir la formación de biopelículas por parte de C. albicans (Figuras complementarias S1a-d). De los aislados bacterianos seleccionados, 20 aislados mostraron una actividad anti-biopelícula moderada, y un aislado (designado como cepa 6HZ5) reveló la mayor capacidad de inhibición de biopelículas (> 95%) contra C. albicans (Figura complementaria S1b). Además, los resultados revelaron que el CFCS de la cepa bacteriana 6HZ5 no afectó el crecimiento de las células de C. albicans.

Curiosamente, los resultados de las pruebas de detección mostraron que pocos aislados bacterianos también tenían el potencial de mejorar la formación de biopelículas. Por ejemplo, se descubrió que los aislados bacterianos designados como 9SZ1, 9SZ2 y 9SA3 mejoran el potencial de formación de biopelículas de C. albicans en un 40% en comparación con sus controles correspondientes. Después de una evaluación cuidadosa de los resultados generales del cribado, llegamos a la conclusión de que el CFCS de una cepa bacteriana marina 6HZ5 tenía la actividad antibiopelícula más fuerte contra C. albicans y, por lo tanto, se seleccionó este aislado en nuestro estudio. Según el análisis de la secuencia del gen 16S rRNA, el aislado bacteriano seleccionado con potente actividad antibiopelícula se identificó como la cepa 6HZ5 de Brevundimonas abyssalis. Además, se construyó un árbol filogenético utilizando 32 secuencias del gen 16S rRNA de referencia de Brevundimonas spp. (Figura complementaria S2). La cepa 6HZ5 de la bacteria B. abyssalis seleccionada mostró una estrecha similitud filogenética con B. canariensis. Estas dos bacterias también formaron un clado separado de las otras especies del género Brevundimonas.

Se utilizó el análisis HR-LCMS para identificar los compuestos activos presentes en el CFCS. Los compuestos identificados se enumeran en la Tabla complementaria S1. Para continuar, los compuestos predominantes como el ácido 11-amino undecanoico, 6,8-docosanodiona, 7-acetoxi-4-metilcumarina, 3-hidroxicumarina, sulfadimidina, moracina D y salfredina se adquirieron comercialmente y se analizaron para determinar sus efectos anti. -potencial de biopelícula contra C. albicans.

Se analizó el efecto de los compuestos seleccionados en cuanto a su crecimiento y potencial inhibidor de biopelículas contra C. albicans (Fig. 1). De los siete compuestos analizados, seis compuestos, a saber, 6–8-docosanodiona, 7-acetoxi 4-metil cumarina, sulfadimidina, moracina D y salfredina, mostraron más actividad fungicida que el antibiopelícula y, por lo tanto, fueron eliminados en la selección primaria. Sólo dos compuestos, a saber, el ácido 11-amino undeconoico y el 3HC, inhibieron la biopelícula de C. albicans sin afectar sustancialmente el crecimiento. Entre estos dos potentes inhibidores de biopelículas, se encontró que el 3HC era más significativo (p <0,05) y, en adelante, se eligió el 3HC para examinar su eficacia para inhibir la biopelícula y estudiar su influencia sobre los factores de virulencia de C. albicans.

Detección de compuestos disponibles comercialmente identificados mediante análisis HR-LCMS en sobrenadante de cultivo libre de células (CFCS) de un aislado bacteriano marino Brevundimonas abyssalis para determinar su potencial antibiopelícula contra C. albicans. El gráfico de barras muestra la inhibición de la biopelícula (%) y el gráfico de líneas muestra la absorbancia de las células planctónicas a 600 nm. Dos compuestos, a saber, 3-hidroxicumarina (3HC) y ácido 11-amino undeconoico, mostraron una potente actividad antibiopelícula contra C. albicans. Las barras de error representan desviaciones estándar de la media de los triplicados experimentales.

Inicialmente, la actividad no fungicida del 3HC se confirmó mediante la determinación de la MIC. Entre las cuatro cepas de hongos analizadas, las células planctónicas de la cepa de referencia ATCC de C. albicans fueron las más susceptibles al 3HC, seguidas por los otros tres aislados clínicos. Sin embargo, se observó que la susceptibilidad era insignificante, por lo que se consideró que la CIM de todas las cepas estudiadas era de 1000 µg mL-1. Observamos casi un 50% de muerte celular visible a 1000 µg ml-1 y resultados adicionales revelaron que el crecimiento de C. albicans no se inhibió significativamente (p > 0,05) en concentraciones más bajas (Fig. 2a). Esto se corroboró aún más al probar la viabilidad metabólica de las células en presencia y ausencia de 3HC usando azul Alamar (Fig. 2b).

Determinación de la concentración mínima inhibidora de biopelículas (MBIC) y concentración no fungicida de 3-hidroxicumarina (3HC). MBIC denota inhibición máxima de biopelículas con pérdida insignificante en células planctónicas. ( a ) Se observó una biopelícula de reducción dependiente de la dosis tras el tratamiento con 3HC. La concentración de 250 µg mL-1 se eligió como MBIC ya que la formación de biopelículas se vio obstaculizada > 95% sin ninguna pérdida en el crecimiento planctónico. (b) Medición de la viabilidad metabólica de C. albicans después de 24 h de crecimiento en presencia y ausencia de 3HC, utilizando azul Alamar. La imagen muestra una reducción significativa en la viabilidad celular a 1000 µg ml-1 (CMI) y ninguna reducción en la viabilidad a sub-CIM. Las barras de error indican los valores medios de tres triplicados experimentales. (c) Placa de microtitulación representativa de 96 pocillos teñida con azul de Alamar que muestra el verdadero estado metabólico de las células de C. albicans tratadas con 3HC.

La viabilidad metabólica es un ensayo de observación visual, en el que el azul de Alamar, un tinte de resazurina (tinte de color azul no fluorescente) se reduce a resorufina (tinte fluorescente de color rosa) mediante células metabólicamente activas. Por lo tanto, las células viables se vuelven rosadas y las no viables permanecen azules. Los resultados revelaron una reducción significativa (p <0,05) en la viabilidad celular solo en MIC (1000 µg mL-1), mientras que la intensidad fluorescente permaneció sin cambios en sub-MIC. La intensidad de fluorescencia de las células tratadas con 500 µg mL-1 permaneció casi igual que la del control, y a una concentración de 250 µg mL-1, las células permanecieron completamente viables (Fig. 2b,c). Todos los resultados obtenidos confirmaron que el 3HC no posee ningún impacto fatal sobre el crecimiento y la viabilidad metabólica de C. albicans por debajo de los CMI. Por lo tanto, las concentraciones por debajo de las sub-CIM (62,5 a 500 µg ml-1) se tomaron más a fondo para evaluar el potencial antibiofilm.

Después de confirmar la actividad no fungicida del 3HC, se examinó la actividad antibiopelícula. Se evaluó la capacidad de las cuatro cepas de C. albicans para producir biopelículas. Después de 48 h de incubación en el medio Spider, a excepción de C. albicans C1, las otras tres cepas estudiadas tenían un fuerte potencial de formación de biopelículas. De manera similar, la combinación mixta exhibió una sólida capacidad para formar biopelículas. La tinción con CV reveló el potencial de 3HC para mitigar la capacidad de formación de biopelículas de C. albicans (Fig. 3a y Fig. Suplementaria S3). Las concentraciones de 3HC a 125 µg mL-1, 250 µg mL-1 y 500 µg mL-1 inhibieron un máximo de 72%, 98% y 100% de las biopelículas de C. albicans, respectivamente. Sin embargo, la concentración de 3HC a 500 µg mL-1 mostró una ligera actividad antifúngica (8%), mientras que a 250 µg mL-1 no tuvo efecto sobre el crecimiento de todas las cepas de C. albicans analizadas y, por lo tanto, las curvas de crecimiento fueron Se encontraron similares a los de los controles correspondientes (Figura complementaria S4). Por lo tanto, después de evaluar cuidadosamente los resultados generales obtenidos, se fijaron 250 µg ml-1 como MBIC y se llevaron a cabo para investigar su eficacia sobre los atributos de virulencia de C. albicans. En el caso de la saliva artificial, se observó que incluso la concentración mínima de 3HC exhibió una inhibición completa de la formación de biopelículas de la cepa 90028 de C. albicans (Figura complementaria S5).

Eficacia anti-biopelículas de concentraciones variables de 3-hidroxicumarina (3HC) frente a aislados clínicos y de referencia de C. albicans. ( a ) Efecto de 3HC sobre la inhibición de biopelículas de cepas de C. albicans. La formación de biopelículas de los cuatro aislados de C. albicans analizados se vio obstaculizada > 90% en MBIC (barra azul) de 3HC. Las barras de error representan la desviación estándar de la media (n = 9). (b) Efecto de diferentes concentraciones de 3HC sobre la viabilidad metabólica de biopelículas formadas por varias cepas de C. albicans (aumento de ×200). Se observó una reducción dosis dependiente en la viabilidad de la biopelícula en los cuatro aislados de C. albicans. El tratamiento en MBIC tuvo una reducción significativa en la viabilidad de la biomasa de biopelículas. ( c ) Imágenes FESEM representativas de C. albicans 90028 no tratado y aquellos expuestos a 3HC a 2 MBIC, MBIC, ½ MBIC y ¼ MBIC que muestran una reducción completa de la biopelícula dependiente de la dosis y una inhibición completa de la formación de hifas.

Además, se utilizó el método FDA para detectar la actividad metabólica de las biopelículas. Como se muestra en la Fig. 3b, el MBIC redujo significativamente la actividad celular de las biopelículas de 48 h de todas las cepas de C. albicans. El control y el control con vehículo mostraron poblaciones densas con células hifales alargadas, mientras que los grupos tratados apenas tenían células. Además, apenas observamos protrusión de hifas en ninguna de las células observadas. Se descubrió que las células tratadas con 62,5 µg ml-1 tenían un retraso en el crecimiento de las elongaciones de las hifas (Fig. 3b). Estas observaciones se confirmaron aún más mediante el análisis FESEM (Fig. 3c), que confirmó la inhibición completa de los alargamientos de las hifas y una reducción dependiente de la concentración en la formación de biopelículas de C. albicans 90028.

Se estudiaron rasgos de virulencia como la morfología filamentosa, la morfología de las arrugas, la transición de levadura a hifa y de hifa a levadura tanto en células de control como en células tratadas. Cuando se cultiva en medio Spider suplementado con FBS, la colonia de C. albicans tiende a tener una superficie rugosa con morfología arrugada y, después de 3 a 4 días de incubación, forma filamentos (crecimiento de hifas) (Fig. 4a, b). Sin embargo, se encontró que las colonias tratadas con 3HC en MBIC tenían colonias de bordes lisos y carecían de arrugas (Fig. 4a y Fig. Suplementaria S6) y crecimiento filamentoso (Fig. 4b). También se observó una reducción tanto en las arrugas como en el crecimiento filamentoso con dosis más bajas de 3HC (125 µg ml-1 y 62,5 µg ml-1). Aunque se observó la aparición de filamentos en concentraciones más bajas, su incubación durante un período más prolongado no promovió ningún crecimiento y/o alargamiento adicional de los filamentos.

Inhibición de factores de virulencia primarios (crecimiento de filamentos y morfología de arrugas) mediante el tratamiento con 3HC. Imágenes representativas de placas de agar en medio Spider muestran la morfología de las colonias expuestas a 2 MBIC, MBIC, ½ MBIC y ¼ MBIC de 3HC. Después del tratamiento, la colonia parecía tener (a) una superficie lisa y (b) un crecimiento de filamentos reducido en comparación con el de su control respectivo. Se ha aplicado color falso a las imágenes (b) para representar los resultados con claridad.

El requisito previo para la formación de biopelículas de C. albicans, la transición de hifas, también respondió de manera similar. Se observó una red de hifas compleja y altamente entrelazada en el caso de las células de control, mientras que las células tratadas con 3HC (en MBIC) exhibieron células de levadura dispersas sin protuberancias de hifas. Las imágenes de microscopía óptica de células de control y tratadas con 3HC mostraron claramente una reducción en la adherencia a la superficie de C. albicans y el desarrollo de hifas (Fig. 5a). El espesor y la intensidad de la biopelícula y la capacidad de las células para pasar del modo levadura al modo hifal se redujeron significativamente. La reducción en la transición hifal se encontró incluso con la concentración mínima (62,5 µg mL-1) de 3HC. Se encontró que las células de control eran estructuralmente estables con protuberancias hifales complejas.

Eficacia de la 3-hidroxicumarina (3HC) en la transición morfológica y la desintegración de la biopelícula madura de células de C. albicans. Imágenes microscópicas que muestran (a) inhibición de la formación de hifas y (b) reversión de hifas preformadas a células de levadura a 2 MBIC, MBIC, ½ MBIC y ¼ MBIC. (c) Desintegración de biopelícula madura por 3HC en diversas concentraciones. El desprendimiento máximo de la biopelícula preformada se observó a 2 MBIC. Cada experimento se repitió al menos tres veces y aquí se presentan imágenes representativas.

Además, la capacidad de revertir la transición de hifas a levaduras también es una propiedad muy necesaria de un potente compuesto anti-biopelícula. Por lo tanto, la capacidad de 3HC para revertir las células hifales preformadas se probó cultivando células en el medio RPMI, que facilita el crecimiento de las hifas. El monitoreo continuo de las células tratadas con 3HC a intervalos de 4 h reveló que la reversión de hifa a levadura se inició después de 4 h de tratamiento con 3HC (Fig. 5b). Además, el 3HC también mostró reversibilidad dependiente de la dosis y del tiempo. Por ejemplo, el tratamiento con MBIC provocó una reversión de la transición de hifa a levadura después de 8 h (~ 90%), mientras que con 62,5 µg mL-1, la reversión máxima se observó después de 12 h.

La eficiencia para alterar la biopelícula preformada es un atributo crucial de un potente candidato a antibiopelícula. Para probar esta capacidad, se permitió que C. albicans 90028 formara una biopelícula durante 48 h. Observamos que 3HC tanto en MBIC como en 2 × MBIC tenía la capacidad de desalojar las células adheridas a la superficie después de 24 h de incubación (Fig. 5C).

Dado que todos los ensayos sobre fisiología demostraron reducciones significativas en la adhesión y el cambio fenotípico, los genes que están involucrados en la formación de biopelículas, la morfogénesis de las hifas y la transición de levadura a hifa fueron el objetivo principal para determinar su expresión diferencial a través del análisis qPCR para validar la capacidad de 3HC a nivel del genoma (Figura complementaria S7).

Como se esperaba, los resultados revelaron que los genes responsables de la adhesión, como als1 y eap1, estaban regulados negativamente significativamente (p <0,05) con un cambio de 6 y 4 veces, respectivamente. La expresión de genes responsables del desarrollo de hifas y filamentos, como hst7 y ume6, fue la más significativamente (p <0,005) regulada a la baja (>10 veces). Además, la regulación negativa de otros genes relacionados con la adhesión y la filamentación, incluidos efg1, cph1, eap1, ras1, als1 y ece1, corrobora aún más la eficacia in vitro de 3HC en el control de cambios antibiopelículas, antihifales y fenotípicos (Figura complementaria .S7).

La naturaleza no tóxica del 3HC se evaluó frente a células epiteliales de la cavidad bucal (Fig. 6a) y eritrocitos (Fig. 6b). En ambas células, su respectivo control positivo ejerció un efecto adverso sobre las células. Por ejemplo, Triton X-100 provocó la lisis completa de los eritrocitos, dando como resultado una solución de color rojo. De manera similar, el peróxido de hidrógeno desintegró completamente la estructura de los HBEC. Sin embargo, el tratamiento con 3HC no tuvo ninguna influencia negativa en ambos casos, lo que indica su naturaleza no tóxica, sin pérdida de estructura o integridad celular.

Efecto no tóxico del 3HC sobre (a) células epiteliales bucales humanas (HBEC) y (b) eritrocitos humanos. Se utilizaron peróxido de hidrógeno y Triton X-100 como controles positivos para HBEC y eritrocitos, respectivamente. Ambas células tratadas con diferentes concentraciones de 3HC (62,5 a 500 µg mL-1) no mostraron ningún efecto tóxico, excepto el control positivo. VC denota control del vehículo (etanol).

A nivel mundial, C. albicans es la principal causa de candidiasis invasiva. Varios estudios epidemiológicos han demostrado que la formación de biopelículas aumenta la mortalidad de la candidiasis invasiva41,42. C. albicans tiene más probabilidades de formar biopelículas que otras especies de Candida como C. tropicalis y C. glabrata43. Generalmente, una biopelícula formada por C. albicans está formada por una red de hifas tridimensionales y una matriz extracelular muy dinámica y extremadamente estructurada. En comparación con sus homólogos planctónicos, las células de C. albicans en la biopelícula responden menos a los fármacos antimicóticos de uso común, como los azoles y la anfotericina B44,45 convencional. Debido a la infectividad de los fármacos antifúngicos comúnmente utilizados contra el estilo de vida de las biopelículas de C. albicans, su uso excesivo se practica ampliamente, lo que a su vez favorece el desarrollo de resistencia a múltiples fármacos46. Además, la resistencia a múltiples fármacos también potencia la recurrencia de fracasos terapéuticos debido al ejercicio de presión selectiva ejercida por los fármacos antimicóticos convencionales47,48. Teniendo en cuenta la gravedad de las enfermedades relacionadas con las biopelículas, es imperativo encontrar fármacos antimicóticos alternativos que puedan controlar eficazmente las biopelículas sin afectar el crecimiento de las células planctónicas.

Para hacer frente a esto, en este estudio se utilizaron metabolitos producidos por consorcios bacterianos formadores de biopelículas naturales. Los compuestos derivados de comunidades bacterianas marinas son muy valiosos para promover la supervivencia bacteriana, particularmente en entornos competitivos como las biopelículas marinas. El análisis de varios extractos bacterianos en busca de compuestos anti-biopelículas reveló la eficacia de la mayoría de los extractos. Curiosamente, algunos aislados bacterianos también observaron la capacidad de mejorar la biopelícula. Esta capacidad indica la naturaleza de la bacteria y su entorno, es decir, la biopelícula natural. Generalmente, la comunidad bacteriana que reside en biopelículas marinas exhibe un comportamiento tanto sinérgico como competitivo49. El comportamiento sinérgico promueve el crecimiento de comunidades de vida periféricas, mientras que el comportamiento competitivo tiene el efecto contrario. Los aislados bacterianos que mostraron capacidad de mejora de la biopelícula podrían mostrar un comportamiento cooperativo con otros miembros bacterianos. Sin embargo, para reducir la virulencia de patógenos potentes, los aislamientos bacterianos competitivos desempeñan un papel importante. Los compuestos producidos por estos aislados bacterianos competitivos se exploran ampliamente por sus propiedades antibiopelículas, antimicrobianas y anti-detección de quórum contra bacterias Gram positivas y negativas50,51,52,53. Sin embargo, rara vez se estudia la eficacia de los metabolitos derivados de bacterias marinas (particularmente de biopelículas marinas) contra el hongo patógeno humano, específicamente C. albicans. En este contexto, el presente estudio investigó la eficacia inhibidora in vitro del 3HC producido por una bacteria marina B. abyssalis contra la biopelícula y los factores de virulencia de C. albicans.

La cumarina y sus derivados son compuestos heterocíclicos oxigenados cristalinos polifenólicos naturales que se encuentran predominantemente en las plantas como heterósidos o en forma libre54. Aunque en su mayoría están asociados a plantas, también se ha descubierto que algunos derivados, como la novobiocina, la cumermicina y las aflatoxinas, son producidos por microbios55,56. El compuesto de interés en nuestro estudio (3HC) es una cumarina simple que ha recibido poca atención. Recientemente, se identificó 3HC por su capacidad para inhibir la tirosinasa humana recombinante y se diseñó eficazmente para aplicaciones farmacéuticas tópicas57. Sin embargo, el 3HC no se ha estudiado contra ningún patógeno humano y, por lo tanto, este estudio es el primero en identificar el 3HC de una bacteria marina y determinar su eficacia antibiopelículas contra C. albicans.

Todo el desarrollo de la biopelícula de C. albicans comprende tres fases principales, a saber, las etapas temprana, de desarrollo y de madurez58. En el presente estudio, se observó un efecto inhibidor significativo del 3HC contra la biopelícula de C. albicans. Es importante destacar que el 3HC suprimió aproximadamente el 72 % de la formación de biopelículas en una concentración de 125 µg ml-1 e inhibió completamente (~ 98 %) la formación de biopelículas en una concentración de 250 µg ml-1. Los cambios en la intensidad de la tinción CV en estudios espectroscópicos y microscópicos ópticos confirmaron esta observación. Además, se observó que el efecto antibiopelícula del 3HC dependía de la dosis. A diferencia de las células planctónicas, las células formadoras de biopelículas exhiben características únicas y están encerradas dentro de una matriz extracelular protectora. El MBIC representa la concentración de 3HC necesaria para inhibir la formación y el crecimiento de biopelículas, en lugar de erradicar toda la población microbiana dentro de la biopelícula. Sirve como indicador de la eficacia del compuesto en el manejo de las complicaciones relacionadas con las biopelículas al impedir el desarrollo de las biopelículas. Este enfoque reconoce las características únicas de las biopelículas y tiene como objetivo mitigar sus efectos perjudiciales, como una menor susceptibilidad a los antibióticos y una mayor patogenicidad, en lugar de centrarse únicamente en la destrucción de microbios. La alta naturaleza hidrófoba del 3HC habría impedido que las células se adhirieran a la superficie57. Además, un compuesto antibiopelícula ideal tampoco debería ser fungicida para prevenir las posibilidades de desarrollo de resistencia59. Según los resultados del ensayo de viabilidad, se demostró que el 3HC tiene efectos no mortales, lo que refuerza aún más su eficacia como potente agente antibiopelículas. Además, la inhibición completa de la formación de biopelículas en el caso de la saliva artificial podría atribuirse a su naturaleza ácida. Las formulaciones de saliva artificial generalmente se esfuerzan por replicar el pH ligeramente ácido (que oscila entre 6,2 y 7,6) de la saliva natural. Esta acidez juega un papel crucial en el establecimiento de un entorno menos favorable para el crecimiento de C. albicans. Además, la introducción de 3HC podría haber mejorado aún más la inhibición de la formación de biopelículas, lo que habría resultado en una inhibición más eficaz.

La adherencia de las células de Candida a cualquier superficie es el paso principal en la cascada de formación de biopelículas. Después de la adhesión a una superficie, las células de levadura se desarrollan gradualmente en formas de hifas, lo que se considera muy importante tanto para la formación como para la diseminación de biopelículas60. Además, la adhesión celular y la transición de levadura a hifa son elementos patogénicos cruciales en C. albicans, que se sabe que provocan activamente la invasión de las células de Candida en el huésped60. Esto se descubrió en un estudio de Saville et al.61, en el que se inyectó a un grupo de ratones una cepa de C. albicans modificada que podía modularse externamente para la transición de la morfología de levadura a hifas. Esto lo lograron colocando el regulador negativo del gen de filamentación; nrg1 bajo el control de un promotor regulable por tetraciclina y descubrieron que los ratones inyectados con esta cepa sucumbieron a la infección, mientras que el control no62. Por lo tanto, la inhibición de estos elementos patógenos induce un defecto en la formación de biopelículas, que es un objetivo clave en los tratamientos específicos de biopelículas63,64.

El ensayo de filamentación mostró que el 3HC obviamente inhibía la transición morfológica de las células de Candida albicans. A partir de 62,5 µg mL-1 de 3HC, un gran número de células quedaron encerradas en forma de levadura y en concentraciones más altas, el 3HC inhibió completamente el crecimiento filamentoso. De manera similar, después de la adhesión y el crecimiento celular, las arrugas superficiales de la colonia aumentan su superficie para adquirir nutrientes y para un mayor desarrollo de hifas y producción de adhesinas65. El compuesto activo, 3HC, incluso en su concentración más baja (62,5 µg ml-1) restringió la formación de arrugas en la superficie de la colonia. La prevención de estos factores virulentos que son altamente necesarios para la invasión, fijación y formación de biopelículas valida que el 3HC evidentemente podría impedir las infecciones por C. albicans.

Además de actuar contra los factores de virulencia para el inicio temprano de biopelículas, también se descubrió que 3HC actúa eficazmente sobre biopelículas maduras y factores de virulencia. Por ejemplo, el 3HC indujo potencialmente la transición de hifas a células de levadura y alteró significativamente la biopelícula madura. Esta transición es ventajosa en casos de infección madura, donde la inhibición de los factores de virulencia puede aumentar la susceptibilidad de las células Candida a la respuesta inmune y la terapéutica del huésped.

Además, para dilucidar el posible mecanismo anti-biopelícula de 3HC, se realizó qPCR y se determinaron los cambios en los niveles de transcripción. Los genes se seleccionaron en función de la regulación positiva de factores de virulencia iniciales como la adhesión y la morfogénesis. Los resultados revelaron la regulación negativa de los genes implicados en la virulencia, incluidos als3, cph1, eap1, efg1, hst1, hwp1, ras1 y ume6. La familia de genes als, incluido als3, desempeña un papel crucial en la adhesión de las células de levadura y es una parte integral de la formación de biopelículas. Otros factores transcripcionales como efg1 y cph1 son los primeros reguladores identificados del desarrollo de hifas y regulan sinérgicamente los genes de virulencia66. El factor de transcripción específico de las hifas hwp1 regula el desarrollo de las hifas, la eficiencia del apareamiento y la integridad de la biopelícula. La regulación negativa de hwp1 y als3 observada en este estudio indica la reducción de la capacidad de adhesión y virulencia celular, lo que podría causar aún más el desprendimiento de biopelículas de sustratos abióticos66,67. La regulación negativa de genes como ume6 y ras1, que son responsables del cambio morfológico (de levadura a hifal) y de los filamentos polarizados, respectivamente, tras el tratamiento con 3HC, confirma su potencial anti-biopelícula68. En general, nuestros resultados de qPCR concluyeron que el 3HC impide los factores de virulencia primarios más cruciales, incluida la adhesión y la morfogénesis que son necesarias para la formación de biopelículas por parte de las células de C. albicans.

A pesar de todo lo anterior, para aplicaciones clínicas, un compuesto no debe ser tóxico para las células humanas. En este caso, el objetivo son los eritrocitos humanos y las HBEC en relación con la candidiasis intestinal y oral. Los resultados no mostraron ningún efecto tóxico por parte del compuesto activo 3HC, lo que confirma su potencia para aplicaciones clínicas. Además, un estudio previo también informó el efecto no citotóxico del 3HC en las células de melanoma B16F1057.

En conclusión, este estudio demostró, por primera vez, la eficacia antibiopelícula y antivirulencia del 3HC, un compuesto derivado de una bacteria marina, en C. albicans. Este compuesto afectó de manera destacada la adherencia inicial de C. albicans e inhibió la transición morfológica de las células de levadura. El compuesto 3HC no solo inhibió específicamente la formación de biopelículas y el desarrollo de hifas, sino que también impide la expresión de genes que participan positivamente en la adhesión inicial, la morfogénesis y la formación de biopelículas en C. albicans. Los resultados de los experimentos de toxicidad con eritrocitos humanos y HBEC confirmaron la naturaleza inocua del 3HC. Dada su destacada actividad antibiopelícula y antivirulencia contra C. albicans con naturaleza no fatal y no tóxica, el 3HC puede considerarse un compuesto prometedor para evadir la aparición de infecciones mediadas por biopelículas causadas por C. albicans. En general, el presente estudio define nuevos conocimientos para la identificación de nuevos bioactivos en un entorno altamente competitivo como la biopelícula marina. En estudios futuros, descifrar los mecanismos moleculares detallados del 3HC utilizando enfoques transcriptómicos y proteómicos sería una contribución científica significativa.

Los datos que respaldan el hallazgo de este estudio se proporcionan en el manuscrito. La lectura de secuenciación del gen bacteriano 16S rRNA generada durante el estudio actual está disponible en GenBank del NCBI con el número de acceso MZ357100.

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El trabajo de investigación fue apoyado financieramente por el Departamento de Energía Atómica-Junta de Investigación en Ciencias Nucleares (DAE-BRNS), Gobierno de la India (Subvención No.: 51/14/06/2019-BRNS).

Meora Rajeev

Dirección actual: Departamento de Ciencias Biológicas y Bioingeniería, Universidad de Inha, Inharo 100, Incheon, 22212, República de Corea

Estos autores contribuyeron igualmente: TJ Sushmitha y Meora Rajeev.

Departamento de Biotecnología, Universidad de Alagappa, Campus de Ciencias, Karaikudi, Tamil Nadu, 630 003, India

TJ Sushmitha, Meora Rajeev, Vellaisamy Kathirkaman, Singh Shivam y Shunmugiah Karutha Pandian

Escuela de Artes y Ciencias, Universidad Sai, OMR, Paiyanur, Tamil Nadu, 603105, India

Toleti Subba Rao

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TJS: Conceptualización, Análisis formal, Investigación, Metodología, Redacción-borrador original, Redacción-revisión y edición. MR: Conceptualización, Redacción-revisión y edición. VK y SS: Experimentos y análisis formal. TSR y SKP: Adquisición de financiación, Administración de proyectos, Supervisión, Redacción-revisión y edición.

Correspondencia a Shunmugiah Karutha Pandian.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sushmitha, TJ, Rajeev, M., Kathirkaman, V. et al. La 3-hidroxicumarina demuestra eficacia antibiopelícula y antihifas contra Candida albicans mediante la inhibición de la adhesión celular, la morfogénesis y la regulación de genes virulentos. Representante científico 13, 11687 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37851-1

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Recibido: 03 de abril de 2023

Aceptado: 28 de junio de 2023

Publicado: 19 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37851-1

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